RNA-seq 是轉(zhuǎn)錄組研究的一項(xiàng)基本技術(shù)。 自推出以來，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)百種分析工具，分析中不同步驟所涉及的權(quán)衡（如速度、資源消耗、靈敏度、準(zhǔn)確性等）是至關(guān)重要的。 RNA-seq分析包括序列比對(duì)、轉(zhuǎn)錄本組裝、表達(dá)定量、差異分析、可變剪接、融合基因檢測(cè)、突變分析、RNA編輯等。一般分析不需要貫穿整個(gè)過程，可以簡(jiǎn)化基于你自己的需要。 那么，在給定成本和性能限制的情況下，此類分析工具是否存在確定性的最佳組合？

2017 年，他發(fā)表了關(guān)于轉(zhuǎn)錄組分析過程的研究。 針對(duì)15個(gè)樣本（正常樣本、癌細(xì)胞和干細(xì)胞、短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，借助39個(gè)工具，對(duì)約120個(gè)常見組合進(jìn)行了約490個(gè)深度分析RNA-seq 的形式，并以測(cè)序質(zhì)量控制聯(lián)盟 (SEQC) qPCR 測(cè)量結(jié)果作為陰性對(duì)照，以綜合評(píng)估 RNA-seq 的分析工作流程。 研究人員總結(jié)出一套普適過程，如右圖所示：

RNA-seq 分析的第一步通常是識(shí)別一組表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，這通常涉及將讀數(shù)與適當(dāng)?shù)膮⒖夹蛄羞M(jìn)行比對(duì)，然后根據(jù)比對(duì)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本。 一般以基因組或轉(zhuǎn)錄組序列為參考dnastar拼接序列，以參考基因組為參考可查新轉(zhuǎn)錄本，但需要耗費(fèi)資源的reads ； reads 使用轉(zhuǎn)錄組序列作為參考相對(duì)容易，但不允許檢查新的轉(zhuǎn)錄本。 如果研究物種沒有可靠的參考序列（基因組或轉(zhuǎn)錄組），可以采用de novo 來鑒定轉(zhuǎn)錄本，即沒有“參考”的轉(zhuǎn)錄組，沒有合適的參考序列，組裝轉(zhuǎn)錄本序列從頭開始，然后轉(zhuǎn)錄量化書。 下面從幾個(gè)方面比較不同工具和工具組合的性能。

1. 序列比對(duì)質(zhì)量評(píng)估

研究人員評(píng)估了 STAR 和 STAR 在對(duì)齊和切點(diǎn)預(yù)測(cè)方面的性能。 STAR 仍然具有最高比例的唯一映射讀取對(duì)，即在基因組上具有唯一對(duì)齊位置的讀取比例最高。 與STAR不同的是，STAR只保留-end reads與基因組比對(duì)的序列，對(duì)低質(zhì)量比對(duì)具有較高的容忍度（容忍更多的錯(cuò)配核苷酸和soft-clip干擾）。 soft-clip干擾表明reads末端存在低質(zhì)量核苷酸或，造成無法比對(duì)的干擾。 STAR會(huì)手動(dòng)嘗試剪掉未對(duì)齊的部分，只保留對(duì)齊的部分，不允許soft-clip storm。 在平均比較速度方面，分別比STAR和STAR快2.5倍和約100倍。

2. 解理位點(diǎn)檢查與評(píng)價(jià)

轉(zhuǎn)錄組或RNA測(cè)序獲得的reads與DNA測(cè)序的區(qū)別在于reads可能來源于兩個(gè)（或多個(gè)）外顯子區(qū)域，導(dǎo)致reads的一端在比對(duì)時(shí)與第一個(gè)外顯子對(duì)齊。 前面部分，另一端與第二個(gè)外顯子的后面部分（如右邊的reads）進(jìn)行比較，然后產(chǎn)生切點(diǎn)（site），帶有site的reads稱為reads，有a on the 剪接、鑒定、替代剪切分析和差異分析都非常重要。

研究人員使用維恩圖顯示了不同比較工具測(cè)量的共同和獨(dú)特的切點(diǎn)（如右圖所示）。 數(shù)字代表刀具測(cè)得的切割點(diǎn)數(shù)，百分比代表每組切割點(diǎn)數(shù)。 驗(yàn)證比率。 dbEST 數(shù)據(jù)庫中至少有兩個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽支持的站點(diǎn)被用作陰性對(duì)照。

結(jié)果顯示所有樣品中拼接點(diǎn)驗(yàn)證率最高 (80%-91%)，盡管測(cè)量或預(yù)測(cè)的拼接點(diǎn)總數(shù)明顯多于 STAR。

3. 基于比對(duì)的轉(zhuǎn)錄組組裝評(píng)價(jià)

在基于剪接的比對(duì)之后，轉(zhuǎn)錄組組裝可用于識(shí)別表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本組。 研究人員比較了兩種最廣泛使用的用于下一代測(cè)序數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄組組裝工具和 . 對(duì)于比較部分， , STAR 和 。

除了short-read 檢測(cè)方法，研究人員還對(duì)IDP（ and ）預(yù)測(cè)工具進(jìn)行了研究。 IDP采用混合方法，利用短讀長(zhǎng)輔助長(zhǎng)讀長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)（與基于GMAP相比）。 將預(yù)測(cè)的亞型或轉(zhuǎn)錄本與 v19 中的參考轉(zhuǎn)錄組注釋進(jìn)行比較以測(cè)試準(zhǔn)確性，并且 v19 中缺失的轉(zhuǎn)錄本被認(rèn)為是假陽性 (FP)，即假陰性。

通常，每個(gè)轉(zhuǎn)錄本中包含的外顯子數(shù)量可以作為轉(zhuǎn)錄本組裝質(zhì)量的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，單外顯子轉(zhuǎn)錄本通常被認(rèn)為具有最差的有效性。 從單外顯子轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量來看，約占30%，約占15%，此類單外顯子轉(zhuǎn)錄本約90%為假陰性（FP）。 就拼接轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量而言，比它多了50-200%。 IDP組裝了所有的多外顯子轉(zhuǎn)錄本（很難識(shí)別單外顯子轉(zhuǎn)錄本），其外顯子數(shù)量分布與v19更相似。 并且Iso-Seq算法有94%的單外顯子轉(zhuǎn)錄本和77%的多外顯子轉(zhuǎn)錄本缺失，反映出Iso-Seq方法在檢查新轉(zhuǎn)錄本時(shí)具有更高的靈敏度，但False 較高。

對(duì)于基因水平的組裝，IDP的準(zhǔn)確性和靈敏度最好，IDP組裝了更多的多轉(zhuǎn)錄本基因（右圖b），比IDP更準(zhǔn)確和靈敏。

對(duì)于轉(zhuǎn)錄本級(jí)組裝，IDP 比其他工具準(zhǔn)確 20%，靈敏度介于（更靈敏）和（稍不靈敏）之間。 基于短讀長(zhǎng)的組裝工具中，轉(zhuǎn)錄水平的準(zhǔn)確率平均比IDP高11%，轉(zhuǎn)錄水平的靈敏度高25%； 組裝速度比IDP快60倍左右，比IDP快50倍左右。

4. 成績(jī)單從頭組裝評(píng)估

當(dāng)參考基因組或轉(zhuǎn)錄組缺失時(shí)，可以使用從頭組裝構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本。 研究人員評(píng)估了三種廣泛使用的轉(zhuǎn)錄本從頭組裝工具 Oases 和 -Trans。

傾向于預(yù)測(cè)更長(zhǎng)的亞型和更多的基因和轉(zhuǎn)錄本，Oases 仍然在所有樣本中形成最高的 N10 到 N50 值，表明其在檢查長(zhǎng)亞型方面的優(yōu)勢(shì)。 -Trans 在高表達(dá)基因處有一個(gè)峰值，表明測(cè)量高表達(dá)亞型的強(qiáng)烈傾向，并且在比對(duì)質(zhì)量（與參考的一致性比率）方面平均比 Oases 高 3%。 將構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄本與參考注釋進(jìn)行比較，-Trans和-Trans分別具有更高的內(nèi)含子水平精度和靈敏度，Oases和-Trans在內(nèi)含子鏈水平精度方面優(yōu)于-Trans。

5.表達(dá)式的定量比較

傳統(tǒng)的表達(dá)分析是直接將reads與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對(duì)，然后估計(jì)轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)量。 如果您需要檢查新識(shí)別的轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)量，您可以使用轉(zhuǎn)錄組組裝工具，例如和。 當(dāng)只關(guān)注已注釋基因的定量時(shí)，可以使用reads直接比對(duì)參考轉(zhuǎn)錄組，然后使用RSEM等工具提高生產(chǎn)力。 例如，經(jīng)典的無參考轉(zhuǎn)錄組首先與基于從頭組裝工具的參考轉(zhuǎn)錄組組裝在一起。

另一種基于轉(zhuǎn)錄本的量化方法是直接判斷reads從哪些轉(zhuǎn)錄本開始，無需比對(duì)，在估算資源上更經(jīng)濟(jì)。 , , quasi- 和 是這種估計(jì)方法的代表，解決了每個(gè)reads是由哪個(gè)異構(gòu)體產(chǎn)生的問題。

研究人員比較了基于基因組比對(duì)的定量工具（使用不同的比對(duì)工具）、基于轉(zhuǎn)錄組比對(duì)的定量工具與-Aln、無比對(duì)的定量工具、-SMEM 和-Quasi，以及基于長(zhǎng)讀長(zhǎng)的 IDP（使用不同的短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)比較工具），利用上述組合得到一個(gè)樣本的基因表達(dá)譜，對(duì)表達(dá)量取對(duì)數(shù)，進(jìn)行秩和相關(guān)分析，評(píng)價(jià)表達(dá)譜的相似性。 結(jié)果表明，定量結(jié)果與其他工具的相關(guān)性最差（大于0.4），無需將直接定量工具與估計(jì)結(jié)果進(jìn)行比較，相關(guān)系數(shù)為0.6-0.8。 -具有基于轉(zhuǎn)錄組比對(duì)的工具和 -Aln 的 SMEM 集群，并且 -SMEM 運(yùn)行得更快。

研究人員還比較了同一樣本的不同測(cè)序讀數(shù)（MCF7-100 和 MCF7-300）的數(shù)據(jù)，以評(píng)估定量穩(wěn)定性。 兩個(gè)對(duì)齊無關(guān)的量化工具和-SMEM 具有最一致的量化結(jié)果。 總體而言，STAR-based比對(duì)結(jié)果的定量穩(wěn)定性高于STAR-based比對(duì)，盡管作為短讀比對(duì)工具，它在預(yù)測(cè)一致性方面最有效。 綜上所述，non--based 是高效的，和 的組合是-based量化工具中性能最好的，但是速度比non--based工具慢了一個(gè)數(shù)量級(jí)。 通過比較不同的比較工具，研究人員認(rèn)為在分析具有挑戰(zhàn)性的樣本時(shí)，Sum 優(yōu)于 STAR。

6. 差異表達(dá)分析與評(píng)價(jià)

識(shí)別不同樣本或不同處理?xiàng)l件下的差異表達(dá)基因集是許多RNA-seq的重要目標(biāo)，檢查差異表達(dá)基因的方法有很多，包括-based、limma和edgeR、-based和無需比較和量化用于差異分析。 在 SEQC 樣本（SEQC-Avs.SEQC-B 和 SEQC-Cvs.SEQC-D）中通過 qRT-PCR 量化的 1001 個(gè)基因被用作對(duì)照來評(píng)估差異分析工具的性能。

在所有組合中，性能最好，而 、limma 和 edgeR 的性能稍差。 對(duì)于準(zhǔn)確性， 和 的準(zhǔn)確性仍然高于基于 的工具。 基于的工具比基于的工具效率更高，無需比對(duì)直接量化的工具可以獲得高質(zhì)量的差異分析結(jié)果。 對(duì)于 AUC-30 的恐懼，edgeR 表現(xiàn)最好，但與它相差不大。

7. RNA-seq 變異分析的評(píng)價(jià)

測(cè)量基因組和轉(zhuǎn)錄組變異對(duì)于理解基因表達(dá)的調(diào)控和可能影響基因表達(dá)的癌癥相關(guān)變異至關(guān)重要，而 GATK 通常用于 RNA-seq 變異分析。 分析發(fā)現(xiàn)，與STAR不同的是，GATK和STAR在用于對(duì)比時(shí)具有相似的性能，總體上兩者在不同樣本上的執(zhí)行時(shí)間相似。

8. RNA 融合檢查評(píng)估

RNA-seq 的另一個(gè)重要應(yīng)用是融合基因的測(cè)量，融合基因通常在各種疾病類型的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 常用JAFFA、STAR-、-、以及從RNA-seq中識(shí)別融合風(fēng)暴。 除了基于短讀長(zhǎng)的分析工具外，IDP- 和 Iso-Seq 還可以從長(zhǎng)讀長(zhǎng) RNA-seq 數(shù)據(jù)中識(shí)別融合基因。

研究人員使用 MCF-7 卵巢癌細(xì)胞系中的 71 個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的基因融合對(duì)該工具進(jìn)行了評(píng)估。 具有最敏感和準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)，也表現(xiàn)出更高的靈敏度，而基于長(zhǎng)讀的 IDP- 表現(xiàn)出最好的準(zhǔn)確性。

在運(yùn)行速度方面，STAR-比其他工具快10倍以上，而and-估計(jì)資源需求更高。

總結(jié)：RNA-seq 分析中工具和估計(jì)方法的選擇對(duì)分析的準(zhǔn)確性和運(yùn)行時(shí)間有很大影響。 具有最快和最準(zhǔn)確的拼接對(duì)準(zhǔn)，盡管不如 STAR 敏感，因此可能是涉及可變剪切剖面的管道的優(yōu)先選擇。 在大多數(shù)情況下，它比 . 更快、更準(zhǔn)確。 和edgeR提供了最準(zhǔn)確的差分分析dnastar拼接序列，可以作為差分分析的首選。 當(dāng)用作比對(duì)工具時(shí)，GATK 同樣適用于變異分析。

盡管缺少一些單外顯子亞型，IDP 和 Iso-Seq 等長(zhǎng)讀長(zhǎng)格式可以識(shí)別短讀技術(shù)遺漏的許多新的多外顯子轉(zhuǎn)錄本，這表明廣度對(duì)于識(shí)別新的多外顯子變異很重要。 然而，它在準(zhǔn)確預(yù)測(cè) RNA 融合干擾方面也具有顯著優(yōu)勢(shì)，盡管可能會(huì)有更高的實(shí)驗(yàn)成本。 -SMEM 和其他無對(duì)齊工具具有最一致和準(zhǔn)確的量化，前提是不需要檢查新的異構(gòu)體（可能只針對(duì)少數(shù)類型物種，它們具有相對(duì)可靠的異構(gòu)體信息），-SMEM 可以用作最精確但資源高效的解決方案。

研究人員通過不同的工具組合對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)集進(jìn)行了剖析，明確了哪種工具更適合轉(zhuǎn)錄組分析。 似乎從測(cè)試數(shù)據(jù)集的可以推導(dǎo)出在整體方面更有優(yōu)勢(shì)的各個(gè)工具的性能和工具組合，不一定完全適用于特定的數(shù)據(jù)集或目標(biāo)基因我們很關(guān)心。 如果有興趣并且有分析能力，對(duì)于個(gè)人來說，也可以考慮用不同的組合來分析同一個(gè)目標(biāo)數(shù)據(jù)集，然后用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的結(jié)果作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)于大多數(shù)研究者來說是沒有必要的。

參考：

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