1：引物設(shè)計(jì)原則

(1)引物長度為17～25bp，擴(kuò)增序列長度為90～150個(gè)堿基，GC含量為40～60％。

(2) Tm值為50℃至60℃，上游引物和下游引物的Tm值相差不能超過5℃。

(3) 引物序列A、G、C、T整體分布盡量均勻，不能有局部GC富集或AT富集(特別是3'端)，避免T/T的連續(xù)結(jié)構(gòu)C 或 A/G。 避免單個(gè)堿基連續(xù)重復(fù)超過 4 次。

(4) 3'端5個(gè)堿基中G或C不能超過2個(gè)。

(5)避免引物內(nèi)部或兩個(gè)引物之間存在超過3個(gè)堿基的互補(bǔ)序列，避免兩個(gè)引物之間3'端存在超過2個(gè)堿基的互補(bǔ)序列。

(6) 探針應(yīng)盡可能靠近上游引物但不應(yīng)重疊。

(7)引物設(shè)計(jì)完成后，使用-BLAST搜索確認(rèn)引物的特異性。

2：探頭設(shè)計(jì)原理

(1) 探針長度不應(yīng)超過30bp。 理想情況下，15bp 可產(chǎn)生最佳特異性。

(2) 確保探針的Tm值比引物高5-10℃，在退火過程中會(huì)優(yōu)先與模板結(jié)合。

(3)探針的5'端不能是G。當(dāng)G堿基與FAM熒光報(bào)告基團(tuán)連接時(shí)，G也可以猝滅FAM基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)。

(4)探針應(yīng)盡量避免二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

(5)選擇C多于G的鏈作為探針。 G多于C會(huì)降低反應(yīng)效率。

(6)避免多個(gè)重復(fù)堿基的出現(xiàn)，特別是4個(gè)或更多的G堿基。

三：引物和探針設(shè)計(jì)工具

小編推薦的軟件有：5、6、.0.1、、、等。

四：熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)

當(dāng)前的探針方法 qPCR 利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 現(xiàn)象。 探針上有一對(duì)可以產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基團(tuán)。 利用酶的裂解來改變兩個(gè)基團(tuán)之間的距離dnastar引物設(shè)計(jì)，最終使系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。

五：MGB探針和SNP分型檢測

近年來出現(xiàn)的MGB探針在Taq-Man探針的3端添加了二氫環(huán)化的吲哚卟啉三肽（DPI3），可以插入DNA的小溝中，使得較短的探針更加高效。 TM 值增加了雜交反應(yīng)的特異性。

當(dāng)SNP分型檢測探針出現(xiàn)堿基錯(cuò)配時(shí)，需要較大的熱力學(xué)差異才能檢測。 常規(guī)探針長度較長dnastar引物設(shè)計(jì)，單堿基錯(cuò)配對(duì)整體探針Tm的影響較小。 野生型和突變型探針區(qū)分效果差，靈敏度低，容易出現(xiàn)誤判。 原則上，只要有堿基突變，MGB探針就會(huì)檢測到（MGB探針不會(huì)與目標(biāo)片段雜交，不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)）。

6：MGB探頭設(shè)計(jì)原理

(1)探頭長度不宜過長。 一般來說，MGB探針長度在13-20nt之間。

(2)突變位點(diǎn)堿基應(yīng)位于探針中間1/3處(將探針分成三等份，SNP位于中間)。 如果這個(gè)位置不合適，無法設(shè)計(jì)出優(yōu)秀的探針，可以將SNP位置移至3'端，更靠近MGB組。 避免將突變位點(diǎn)放在最后三個(gè)核苷酸內(nèi)。

(3)其余參考普通探頭的設(shè)計(jì)原理。

7：多探頭設(shè)計(jì)原則

(1)設(shè)計(jì)多重系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)注意所有目標(biāo)基因的引物或探針的Tm值應(yīng)接近。 引物的Tm值一般為55-60℃。

(2) 不同靶基因的探針選擇不同的熒光標(biāo)記基團(tuán)，并選擇發(fā)射波長之間穿透力最小的熒光報(bào)告基團(tuán)，如常用的FAM、VIC、ROX、CY5等。

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