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熒光探針?lè)ㄊ褂眯蛄刑禺愋詿晒鈽?biāo)記探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物。 探針?lè)椒ǖ某霈F(xiàn)使得定量PCR技術(shù)的特異性遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR技術(shù)。 目前比較常提到的有探針、FRET雜交探針（熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針）和分子信標(biāo)。

探針?lè)ㄒ驯粡V泛使用，但有人認(rèn)為該技術(shù)利用了Taq酶的5`-3`核酸外切酶活性。 一般試劑廠家只校準(zhǔn)Taq酶的聚合酶活性，并不校準(zhǔn)Taq酶的5`-3`核酸外切酶活性。 3`核酸外切酶活性校準(zhǔn)，不同批次試劑會(huì)帶來(lái)定量差異。 另外，探針的熔點(diǎn)溫度（Tm）只要求高于60℃，這使得不同試劑盒的特異性參差不齊，難以做質(zhì)控檢測(cè)。

1. 實(shí)時(shí)熒光探針設(shè)計(jì)

總原則：探針選擇必須保守，引物選擇必須保守。 因此，必須找到100-200 bp的相對(duì)保守片段來(lái)設(shè)計(jì)引物和探針。 即實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增片段為50bp-150bp。 當(dāng)找不到150bp的保守片段時(shí)，需要保證探針片段的保守性。

設(shè)計(jì)探針和引物時(shí)，請(qǐng)考慮在兩條鏈上設(shè)計(jì)引物和探針。 但需要注意的是，在該鏈上設(shè)計(jì)探針時(shí)，應(yīng)靠近同一條鏈上設(shè)計(jì)的引物（即上游引物）。 這樣可以保證以后的擴(kuò)增時(shí)，即使擴(kuò)增不完全，也會(huì)報(bào)告出熒光信號(hào)。 兩者之間的最佳距離是探針的5'端與上游引物的3'端相距1個(gè)堿基，但它們也可以重疊。

如果在原始序列中找不到合適的探針和引物（1）主要是因?yàn)樘结樑c上游引物距離太遠(yuǎn)，而與下游引物距離較近； 2）突變位點(diǎn)必須在探針的5'端（也可以檢測(cè)到熒光信號(hào)，但在3'端），引物和探針可以設(shè)計(jì)成互補(bǔ)序列。

另外，實(shí)時(shí)PCR中探針和引物的Tm值高于普通PCR中引物和雜交探針的Tm值。

2 探頭設(shè)計(jì)

探頭設(shè)計(jì)的基本原則：

1.保守：探針必須絕對(duì)保守。 有時(shí)，分類僅由探頭確定。 理論上，如果一個(gè)堿基不配對(duì)，就可能檢測(cè)不到。 如果找不到完全保守的片段，則只能選擇有一個(gè)堿基差異的片段。 不同堿基最好放在探針中間，這樣對(duì)探針與目標(biāo)片段的雜交影響不大。 兩端最好不要放置不同的堿基，因?yàn)閮啥瞬焕谔结樀碾s交。 而且最好是A或T，而不是G或A，因?yàn)锳和T是雙鍵，而G和A是三鍵。

2、探針長(zhǎng)度：探針長(zhǎng)度優(yōu)選在25-32bp之間，Tm值在68-72℃之間dnastar引物設(shè)計(jì)，優(yōu)選70℃。 確保探針的Tm值高于引物的Tm值。 10°C，以確保退火過(guò)程中探針在引物之前與目標(biāo)片段結(jié)合。 因此，探針最好是富含GC的保守片段，以保證較高的Tm值。 現(xiàn)在有MGB探測(cè)器。 TAMER后標(biāo)記MGB可以使探針的Tm值更高。 即使探針片段較短，也能達(dá)到探針的Tm值要求（68-70℃）。

3.探針名稱：應(yīng)標(biāo)明探針在基因組中的位置和長(zhǎng)度。

4.探針Tm值計(jì)算：Tm值可以使用oligo或軟件計(jì)算。 確保探針中的 GC 含量為 30-80%。 應(yīng)避免探針中出現(xiàn)多個(gè)重復(fù)堿基，尤其是 4 個(gè)或更多 G 堿基。

5.探針的評(píng)估：使用軟件中的軟件，點(diǎn)擊“日志”菜單中的“ ”，在“名稱”中輸入探針的名稱和位置，按Tab鍵輸入“”，粘貼或輸入探針待分析 針序列。 選擇整個(gè)序列后，選擇“”菜單下的“自二聚體”即可分析探針的二聚體。 彈出窗口告訴探針有多少個(gè)二聚體，并使用 dG 值評(píng)估探針（通常給出最差的 dG 值。理論上，dG 值越大越好）。 在“”菜單“ ”下，分析探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 彈出窗口會(huì)告訴您有多少個(gè)探針并評(píng)估這些探針。 在多重?zé)晒釶CR過(guò)程中，需要通過(guò)“配對(duì)二聚體”來(lái)分析多個(gè)探針。

6. 探針的5'端不能是G，因?yàn)榧词笷AM熒光報(bào)告基團(tuán)連接單個(gè)G堿基，G也會(huì)猝滅FAM基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)，導(dǎo)致假陰性。

7、探針與引物之間的位置：探針應(yīng)靠近上游引物，即探針應(yīng)靠近同一條鏈上的上游引物。 兩者之間的距離優(yōu)選為從探針5'端到上游引物3'端1個(gè)堿基，但也可以重疊。 確保探針的 5' 端距上游引物的 5' 端至少 4 bp。

喜歡：

探測(cè)

5' → 3' 5' FAM → 3' 染料

發(fā)布順序：

5'--3'

互補(bǔ)的已發(fā)表序列

3'--5'

3'←5'

或者：

5' → 3'

發(fā)布順序：

5'--3'

互補(bǔ)的已發(fā)表序列

3'--5'

材料染料 3' ← MAF5' 3'← 5'

探測(cè)

探測(cè)

3. 引物設(shè)計(jì)

1、上下游引物要保守

為了擴(kuò)增所需的保守片段，必須對(duì)保守的100-200個(gè)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 因此dnastar引物設(shè)計(jì)，引物的選擇必須非常保守。 最好不要有不同的基礎(chǔ)。 如有必要，必須保證引物3'端至少4個(gè)堿基完全保守。

設(shè)計(jì)保守引物時(shí)，在已發(fā)表的序列中尋找保守且一致的區(qū)域。 也就是說(shuō)，在已發(fā)布序列的 5' 端尋找 3' 端至少有 5 bp 保守的引物。 也就是說(shuō)，在已發(fā)布序列的 3' 端使用引物。 發(fā)現(xiàn)的位置在 5' 端至少保留 5 bp。

5'3'

發(fā)布順序：

5'--3'

3'5'

2. 上下游引物長(zhǎng)度和Tm值

上下游引物長(zhǎng)度一般在18-25bp之間，Tm值在58-60℃之間。 確保引物中的GC含量為30-80%。 應(yīng)避免引物中出現(xiàn)多個(gè)重復(fù)堿基，尤其是4個(gè)或更多G堿基。 引物的3'端最好不是G或/和C。引物3'端的5個(gè)堿基中不應(yīng)有2個(gè)G或/和C。

上游引物應(yīng)標(biāo)記為F()，及其在基因組中的位置和長(zhǎng)度； 下游引物應(yīng)標(biāo)記為 R()，及其在基因組中的位置和長(zhǎng)度。 Tm值可以使用oligo或軟件計(jì)算。 上下游引物Tm值差異不應(yīng)超過(guò)2℃，長(zhǎng)度差異不應(yīng)超過(guò)4bp。

3. 引物評(píng)價(jià)

使用軟件中的軟件，點(diǎn)擊“日志”菜單中的“ ”，在“名稱”中輸入引物的名稱和位置，按Tab鍵輸入“”，粘貼或輸入要分析的引物序列。 選擇整個(gè)序列后，選擇“”菜單下的“自二聚體”即可分析引物的二聚體。 彈出窗口會(huì)告訴你引物有多少個(gè)二聚體，并使用dG值評(píng)估引物（通常給出最差的dG值，理論上dG值越大越好）。 在“”菜單“ ”下，分析引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 彈出窗口將告訴您有多少引物并評(píng)估引物。 然后選擇需要的上下游引物，點(diǎn)擊“”菜單下的“配對(duì)”，對(duì)上下游引物進(jìn)行分析。 彈出的窗口會(huì)告訴你這對(duì)引物有多少個(gè)二聚體，并用dG值來(lái)評(píng)估這對(duì)引物（通常給出最差的dG值，理論上dG值越大越好（ dG值通常為負(fù)值），如果絕對(duì)值超過(guò)4.5kcal/mol，則容易導(dǎo)致引物二聚體條帶的產(chǎn)生，降低引物的有效濃度，使PCR反應(yīng)無(wú)法正常進(jìn)行）。 無(wú)需考慮引物和探針之間的配對(duì)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因?yàn)樘结樀腡m值非常高。

4、上下游引物與探針的距離（上下游引物的位置）

理論上，上游引物的3'端距離探針5'端1-20 bp，最好是1 bp。 上游引物最近的3'端距探針3'端4 bp； 下游引物應(yīng)靠近探針的 3' 端。 針之間有一定的距離，但要確保下游引物的3'端距離探針3'端至少15-150 bp。 整個(gè)目標(biāo)片段的長(zhǎng)度最好在50-150bp之間，最長(zhǎng)不應(yīng)超過(guò)200bp。

5. 簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)

為了同時(shí)擴(kuò)增引物位點(diǎn)也有突變的靶片段，如果多個(gè)堿基以相同的概率出現(xiàn)，則需要設(shè)計(jì)一個(gè)代表該位點(diǎn)多個(gè)堿基的簡(jiǎn)并片段。 合成引物時(shí)，合成到該位點(diǎn)時(shí)，不是添加一個(gè)堿基，而是同時(shí)添加以簡(jiǎn)并體為代表的多個(gè)堿基。 這樣，合成的引物本質(zhì)上是多個(gè)引物，只是簡(jiǎn)并亞位的堿基不同。 但對(duì)于簡(jiǎn)并引物，必須考慮每個(gè)引物的Tm值，保證簡(jiǎn)并物代表的不同堿基的不同引物的Tm值相差不超過(guò)2℃。 如果溫度超過(guò)2℃，在保證引物3'端相同的情況下，在Tm值較低的堿基引物5'端添加幾個(gè)堿基，使它們具有相同的Tm值。 但這次不是簡(jiǎn)并引物，而是分別合成兩條長(zhǎng)度不同、簡(jiǎn)并亞位點(diǎn)堿基不同但Tm值相同的引物，最后等濃度混合。

5' → 3'

順序：

'-/NNNNN-3'

RR

4. 實(shí)時(shí)多重 PCR 探針的選擇

1.多重實(shí)時(shí)PCR有兩層含義：一是選擇保守的探針和引物，使用不同的染料標(biāo)記探針，檢測(cè)時(shí)根據(jù)熒光的顏色確定不同的產(chǎn)物。 另一種方法是選擇保守引物，擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的目標(biāo)片段，在反應(yīng)中添加SYBRN染料，最后根據(jù)不同目標(biāo)片段的Tm值確定不同的項(xiàng)目。

2.多重實(shí)時(shí)PCR的熒光探針應(yīng)為同一類型：如同時(shí)探針、同時(shí)MGB探針、或同時(shí)探針。

3. MGB探頭的優(yōu)點(diǎn)

A。 MGB探針較短（14-20bp），使得更容易找到所有序列序列的較短片段的保守區(qū)域。

b. 短片段探針（14-20bp）添加MGB后，Tm值會(huì)提高10℃，更容易滿足熒光探針的Tm值要求。

4 MGB探頭的設(shè)計(jì)原理

1) 避免探針 5' 端出現(xiàn) G。 即使探針被水解成單個(gè)堿基，與報(bào)告基團(tuán)連接的G堿基仍然可以猝滅該基團(tuán)的熒光信號(hào)。

2) 使用軟件評(píng)估Tm值。 Tm 值應(yīng)為 65-67°C。

3) 盡量縮短MGB探針，但探針長(zhǎng)度不應(yīng)小于13bp。

4）盡量避免重復(fù)堿基，尤其是G堿基。 應(yīng)避免四個(gè)或更多 G 重復(fù)。

5）原則上，只要MGB探針中存在堿基突變，MGB探針就會(huì)檢測(cè)到（MGB探針不會(huì)與目標(biāo)片段雜交，不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)）。 因此，在進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)，為了檢測(cè)突變體，即MGB不與目標(biāo)片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，探針目標(biāo)片段產(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，探針的突變位點(diǎn)應(yīng)盡量放置在探頭的中間1/3處。 地方。 注：為了滿足以上四個(gè)要求，可以將探針的突變位點(diǎn)移至3'端，但突變位點(diǎn)至少位于3'端前面2個(gè)堿基（即最后兩個(gè)堿基）進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)必須保證探針的堿基絕對(duì)保守。 另一方面，如果你想進(jìn)行類似的檢測(cè)，你應(yīng)該尋找保守的片段區(qū)域，并且探針中不應(yīng)該有突變位點(diǎn)。 如果探針只有13 bp，則探針仍然不是完全保守的。 有多個(gè)突變，突變位點(diǎn)也應(yīng)該靠近探針的5'端。 這樣，即使存在突變，探針仍然可以與目標(biāo)片段雜交并產(chǎn)生熒光信號(hào)。 另一種方法是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并探針，即使發(fā)生突變也能檢測(cè)到突變。

5. 在多重PCR中，多重PCR中引物和探針之間的相互干擾分析

設(shè)計(jì)完每對(duì)引物和探針后，重新使用軟件中的軟件打開(kāi)同一文件中保存的多重PCR引物文件，然后成對(duì)選擇設(shè)計(jì)的多重引物或成對(duì)選擇設(shè)計(jì)的多重引物。 選擇探針后，進(jìn)入“”菜單下的“配對(duì)”，分析上下游引物。 彈出的窗口會(huì)告訴你這對(duì)引物有多少個(gè)二聚體，并用dG值來(lái)評(píng)估這對(duì)引物（通常給出最差的dG值，理論上dG值越大越好）。

6. 多重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增片段的影響

最好每次多重?cái)U(kuò)增的目標(biāo)片段長(zhǎng)度相同，但長(zhǎng)度不能相差太大。

7.同一亞型明確分為幾組，但引物和探針設(shè)計(jì)策略是同時(shí)擴(kuò)增整個(gè)亞型。

首先，為每個(gè)亞組設(shè)計(jì)保守引物和探針，然后用相同的染料標(biāo)記探針。 這樣，在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中，雖然是多重PCR反應(yīng)，但報(bào)告是相同的染料報(bào)告。

使用熒光標(biāo)記探針檢測(cè)產(chǎn)物的特異性比較強(qiáng)。 該探針常用于熒光定量PCR。 一般探針5'端的熒光標(biāo)記基團(tuán)為FAM、VIC等，探針3'端的熒光標(biāo)記基團(tuán)為FAM、VIC等。 用于塔姆拉等

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