熒光定量PCR技術(shù)利用熒光色素或熒光標(biāo)記的特異性探針對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記和追蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程。 隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)的硬度成比例下降。 每個(gè)循環(huán)后采集一次熒光硬度信號(hào)，這樣可以通過熒光硬度的變化來檢測(cè)產(chǎn)物量的變化，并結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，得到熒光擴(kuò)增曲線并估算待測(cè)試樣本的初始模板。 數(shù)量。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是從定性技術(shù)到定量技術(shù)的飛躍。 利用該技術(shù)，可以對(duì)DNA和RNA樣品進(jìn)行相對(duì)定量、絕對(duì)定量和定性分析。

以下是實(shí)驗(yàn)室多年實(shí)驗(yàn)總結(jié)出來的經(jīng)驗(yàn)，建議大家收藏：

1：質(zhì)粒設(shè)計(jì)原理

(1)質(zhì)粒寬度為17-25 bp，擴(kuò)增序列寬度為90-150個(gè)核苷酸，GC濃度為40-60%。

（2）Tm值在50℃至60℃之間，上游質(zhì)粒和下游質(zhì)粒的Tm值相差不能小于5℃。

(3) 質(zhì)粒序列A、G、C、T整體分布應(yīng)盡可能均勻，不能有部分或（特別是3'端），以免T/C結(jié)構(gòu)連續(xù)或 A/G。 防止單個(gè)核苷酸連續(xù)重復(fù)超過 4 次。

(4) 3'端5個(gè)核苷酸中G或C不得少于2個(gè)。

(5)避免質(zhì)粒內(nèi)或兩個(gè)質(zhì)粒之間出現(xiàn)超過3個(gè)核苷酸的互補(bǔ)序列，避免兩個(gè)質(zhì)粒之間3'端出現(xiàn)超過2個(gè)核苷酸的互補(bǔ)序列。

(6) 探針應(yīng)盡可能靠近上游質(zhì)粒，不能重疊。

(7) 質(zhì)粒設(shè)計(jì)完成后，使用-BLAST搜索確認(rèn)質(zhì)粒的特異性。

二：探頭設(shè)計(jì)原理

(1)探針的厚度最好不超過30bp。 理想情況下，15 bp 可獲得最佳特異性。

(2) 確保探針的Tm值比質(zhì)粒高5-10℃，并在固溶過程中優(yōu)先與模板結(jié)合。

(3)探針的5'端不能是G。當(dāng)G核苷酸與FAM熒光報(bào)告官能團(tuán)連接時(shí)dnastar引物設(shè)計(jì)，G還可以猝滅FAM官能團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)。

(4)探針應(yīng)盡量避免二聚體或頭花結(jié)構(gòu)。

(5)選擇C小于G的鏈作為探針，G小于C的濃度會(huì)提高反應(yīng)效率。

(6)防止多個(gè)重復(fù)的核苷酸，特別是4個(gè)或4個(gè)以上的G核苷酸。

三：質(zhì)粒探針設(shè)計(jì)工具

小編推薦的軟件有：5、6、3.0.1、、、、等。

四：熒光官能團(tuán)和猝滅官能團(tuán)

當(dāng)前的探針方法 qPCR 利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 現(xiàn)象。 探針上有一對(duì)可以形成熒光共振能量轉(zhuǎn)移的官能團(tuán)。 熒光硬度變化。

五：MGB探針和SNP分型測(cè)量

近年來出現(xiàn)的-MGB探針中，在Taq-Man探針的3端添加了可插入DNA小溝的二氫環(huán)化吡啶復(fù)合物三肽（DPI3）dnastar引物設(shè)計(jì)，使得較短的探針具有較短 TM 值較高會(huì)降低雜交反應(yīng)的特異性。

SNP分型測(cè)量探針需要具有較大的熱力學(xué)差異，以便在發(fā)生核苷酸錯(cuò)配時(shí)進(jìn)行測(cè)量。 常規(guī)探針寬度較長(zhǎng)，單個(gè)核苷酸錯(cuò)配對(duì)整體探針Tm的影響較小，野生型和突變型探針區(qū)分效果差，靈敏度低，容易誤判。 原則上，只要有核苷酸突變，MGB探針就會(huì)檢測(cè)到（MGB探針不會(huì)與目標(biāo)片段雜交，不會(huì)形成熒光信號(hào)）。

六：MGB探頭設(shè)計(jì)原則

(1)探針的寬度不宜太長(zhǎng)，通常MGB探針的寬度在13-20nt之間。

(2)突變位點(diǎn)的核苷酸應(yīng)位于探針中間1/3處(將探針分成三段，SNP位于中間)。 如果這個(gè)位置不合適，無法設(shè)計(jì)出好的探針，可以將SNP位置移至3'端，更靠近MGB功能組。 防止突變位點(diǎn)排列在最后三個(gè)堿基上。

(3)其余參考普通探頭的設(shè)計(jì)原理。

七：多探頭設(shè)計(jì)原則

(1)設(shè)計(jì)多重系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)注意所有目標(biāo)基因的質(zhì)粒或探針的Tm值應(yīng)相似，質(zhì)粒的Tm值通常為55-60℃。

(2)不同目的基因的探針應(yīng)選擇不同的熒光標(biāo)記官能團(tuán)，但應(yīng)選擇發(fā)射波長(zhǎng)間穿透力最小的熒光報(bào)告官能團(tuán)，如常用的FAM、VIC、ROX、CY5等。

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