PCR（Chain），英文翻譯為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，可以看作是在體外特殊的DNA復(fù)制。 1983年，日本首先提出了這一想法，并于1985年發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，這是一種簡(jiǎn)單的DNA擴(kuò)增方法，這意味著PCR技術(shù)的真正誕生。 截至目前，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究、基因工程、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、人類(lèi)學(xué)等領(lǐng)域。

PCR原理

PCR技術(shù)的基本原理與DNA的自然復(fù)制過(guò)程類(lèi)似，其特異性取決于與目標(biāo)序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸質(zhì)粒。 PCR由變性-固溶-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟組成： ①模板DNA變性：模板DNA加熱至93℃左右一定時(shí)間后，雙鏈DNA解離，成為單鏈; ②模板DNA與質(zhì)粒固溶（復(fù)性）：模板DNA加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，質(zhì)粒與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)； ③引物延伸：DNA模板-質(zhì)粒結(jié)合物72℃，在DNA聚合酶（如聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，以目的序列為模板，根據(jù)核苷酸互補(bǔ)配對(duì)原理，合成引物新的半保留復(fù)制鏈與模板DNA鏈互補(bǔ)，重復(fù)這個(gè)過(guò)程，可以獲得更多的“半保守復(fù)制鏈”

PCR質(zhì)粒設(shè)計(jì)的基本原則

①引物寬度：15-30bp，通常在20bp左右。

②引物核苷酸：G+C濃度為40-60%。 如果G+C太少，擴(kuò)增效果不好，如果G+C太多，則容易出現(xiàn)非特異性條帶。

③ 兩個(gè)質(zhì)粒之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，特別是防止3'端互補(bǔ)重疊。

④ 引物與非特異性擴(kuò)增區(qū)域序列的同源性不應(yīng)超過(guò)70%，且質(zhì)粒3'端的8個(gè)連續(xù)核苷酸在待擴(kuò)增區(qū)域外不應(yīng)有完整的互補(bǔ)序列dnastar引物設(shè)計(jì)，否則很容易造成非特異性擴(kuò)增。

⑤ 引物的5'端可以進(jìn)行修飾。 如添加限制性酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、使用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記、添加其他短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

PCR反應(yīng)特點(diǎn)

常見(jiàn)問(wèn)題及解答

1、問(wèn)：沒(méi)有出現(xiàn)放大帶？

答：當(dāng)酶和質(zhì)粒質(zhì)量良好時(shí)，不會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。 很有可能是標(biāo)本的消化過(guò)程和模板核苷酸提取過(guò)程出現(xiàn)了問(wèn)題。 例如，模板富含異源蛋白，在提取制備模板的過(guò)程中損失過(guò)多，或者吸入酚類(lèi)物質(zhì)。 因此，為了配制出有效、穩(wěn)定的消化處理液dnastar引物設(shè)計(jì)，程序不能隨意修改。

2. Q：PCR擴(kuò)增條帶與目的序列條帶一致，但條帶更整齊，色溫更高（假陰性）？

答：假陰性的原因如下：①引物設(shè)計(jì)不當(dāng)：所選擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列具有同源性。 進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是非目標(biāo)序列。 為此，需要重新設(shè)計(jì)質(zhì)粒。 ② 目標(biāo)序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。 這些假陰性可以通過(guò)小心輕柔地避免將目標(biāo)物吸入移液器或從離心管中濺出來(lái)解決。 除酶和不耐低溫的物質(zhì)外，所有試劑或設(shè)備均應(yīng)采用高壓滅菌。 所有離心管和進(jìn)樣槍頭均應(yīng)使用一次。

3. Q：出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶？

答：出現(xiàn)非特異性條帶的原因：一是質(zhì)粒與目的序列不完全互補(bǔ)，或者質(zhì)粒聚集產(chǎn)生二聚體。 二是Mg2+離子含量過(guò)低，退火溫度過(guò)高，PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多。 第三是酶的質(zhì)量和數(shù)量，過(guò)多的酶有時(shí)會(huì)造成非特異性擴(kuò)增。 對(duì)策是：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)質(zhì)粒。 減少酶的用量或改用其他酶來(lái)源。 增加質(zhì)粒用量，適當(dāng)減少模板用量，減少循環(huán)次數(shù)。

4、問(wèn)：是否有點(diǎn)狀拖拽或拖尾現(xiàn)象？

答：原因往往是酶用量過(guò)多或酶質(zhì)量差、dNTP含量低、Mg2+含量低、固溶溫度高、循環(huán)次數(shù)過(guò)多等。 對(duì)策是：①減少酶的用量，或更換其他來(lái)源的酶。 ②降低dNTP含量，適當(dāng)降低Mg2+含量。 ③增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

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