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通常，定量PCR實驗流程為：目的基因搜索與比對→探針與質(zhì)粒設(shè)計→探針與質(zhì)粒合成→配置反應(yīng)體系→反應(yīng)參數(shù)→重復(fù)實驗、優(yōu)化條件→獲取曲線數(shù)據(jù)、標準曲線對比→重復(fù)驗證。

第一步：目標基因搜索和比對過程的第一步，可以利用NCBI序列等軟件完成目標DNA或RNA的搜索和比對——這相信很多人在分析基因時都會這樣做測序報告。 第一步要注意的是確保分析的序列在a（，即染色體某些區(qū)域中相鄰DNA片段的重疊）內(nèi)。

第二步：如果其他條件相同，那么這第二步——引物和探針的設(shè)計可以說是定量PCR成敗的關(guān)鍵。 通過總結(jié)各方面經(jīng)驗，有以下基本原則：

一般原則：

*先選擇探針，然后設(shè)計盡可能靠近探針的質(zhì)粒。

*所選序列應(yīng)具有高度特異性，并盡量選擇二級結(jié)構(gòu)最小的擴增片段——這是因為二級結(jié)構(gòu)會影響反應(yīng)效率，并會阻礙酶的擴增。 建議先檢查二級結(jié)構(gòu)。 如果二次結(jié)構(gòu)無法阻止，則應(yīng)相應(yīng)提高固溶溫度。

*擴增厚度不要超過400bp，最好在100-150bp內(nèi)，擴增片段越短，越容易獲得有效的擴增反應(yīng)。 較短的擴增子也往往能確保一致的分析。

*GC濃度保持在20%~80%之間，含有GC的區(qū)域容易發(fā)生非特異性反應(yīng)，導(dǎo)致熒光顏料分析中擴增效率下降，出現(xiàn)非特異性信號。

*為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)防止重復(fù)的堿基序列，特別是G（不能有4個連續(xù)的G）

*質(zhì)粒和探針相互配對檢查以防止二??聚體和發(fā)夾。

質(zhì)粒設(shè)計原則：

*序列選擇應(yīng)在基因的保守片段中

*防止質(zhì)粒本身或與質(zhì)粒之間連續(xù)4次或以上配對，并防止質(zhì)粒本身產(chǎn)生環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)

*典型的質(zhì)粒長度為 18 至 24 個核苷酸。 質(zhì)粒需要足夠長以維持序列奇點并增加序列存在于非感興趣序列位點的可能性。 而厚度小于24個核苷酸的質(zhì)粒并不意味著特異性更高。 較長的序列可能與錯配的序列雜交，從而增加特異性，但雜交速度比短序列慢，從而增加產(chǎn)量。

*55-65°C 時的 Tm 值（由于 60°C 時核酸外切酶活性最高），GC 濃度為 40%-60%

*質(zhì)粒之間的TM差異可防止溫度超過2°C

*質(zhì)粒的3'端阻止使用核苷酸A，質(zhì)粒的3'端阻止3個或更多連續(xù)的相同核苷酸

*為了防止擴增，質(zhì)粒設(shè)計最好跨越兩個外顯子。

*探針技術(shù)要求片段寬度為50bp-150bp

*質(zhì)粒末端（最后5個堿基）不能有超過2個G和C。

探頭設(shè)計原則：

*探針的位置盡可能靠近上游質(zhì)粒

*探針寬度應(yīng)為15-45bp（最好是20-30bp）以確保結(jié)合特異性

* 檢查探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)

*Tm值為65-70℃，一般比質(zhì)粒TM值高5-10℃（至少5℃），GC濃度為40%-70%

*探針的5'端應(yīng)避免使用G胍甾醇——因為5'G會有猝滅作用，但即使裂解也會有猝滅作用。

*整個探針中，核苷酸C的濃度應(yīng)明顯低于G的濃度——高濃度的G會提高反應(yīng)效率，此時應(yīng)選擇另一條配對鏈作為探針。

*為了保證質(zhì)粒探針的特異性，最好在blast中檢查一次設(shè)計的序列。 如果發(fā)現(xiàn)非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計質(zhì)粒探針。

MGB探頭設(shè)計：

*探針的5'端阻止了G，雖然探針被酯化成單個核苷酸，但是附著在報告基因官能團上的G核苷酸仍然可以猝滅該官能團的熒光信號

*Tm值應(yīng)為65-67°C。

*MGB探針應(yīng)盡可能短，但探針的厚度不應(yīng)超過13bp。

*盡量避免重復(fù)的核苷酸，特別是G核苷酸，防止4個或更多的G重復(fù)

*原則上，只要MGB探針中存在核苷酸突變，MGB探針就會檢測到（MGB探針不會與目標片段雜交，不會形成熒光信號）。 因此，在進行SNP檢查時，為了測量突變體，即MGB不與目標片段雜交，不形成熒光信號，而探針的目標片段形成熒光信號測量，探頭盡量放置在中間1/3的地方。

注：為了滿足上述要求的四個條件，探針的突變位點可以連接到3'端，但突變位點在3'端前面至少2個核苷酸（即必須確保探針核苷酸的最后兩個核苷酸絕對保守）以進行SNP檢查。 反之，如果要進行類似的檢查，則應(yīng)找到保守的片段區(qū)域，并且探針中不應(yīng)有突變位點。

如果探針只有13 bpdnastar引物設(shè)計，則探針仍然不完全保守。 突變有好幾個，突變位點也應(yīng)該靠近探針的5'端，這樣即使是突變，探針也能與目標片段雜交，形成熒光信號。 另一種方法是設(shè)計簡并探針，即使是突變也能實現(xiàn)突變的檢測。

第三步：找一家值得信賴的公司來合成質(zhì)粒和探針。 通常，質(zhì)粒合成你很熟悉，但價格相對實惠（尤其是近五年），而探針則相對昂貴。 通常Probe合成的價格在1000到5000元不等（不同的合成需要不同的價格）——而且這只是一個標價，序列合成的價格與質(zhì)粒合成的價格基本相似。

步驟4、5、6：雖然通常的定量PCR反應(yīng)體系與普通PCR沒有太大區(qū)別，但唯一的區(qū)別是探針的添加。 另一個區(qū)別是逐步方法的區(qū)別。 其中，需要注意的是：

*擴增酶最好使用熱啟動酶

*質(zhì)粒和探針的含量需要優(yōu)化。 有人建議從50nM開始，在50nM-900nM之間優(yōu)化，通常是200nM（注意探針需要避光保存）

*等量的Mg和酶也需要優(yōu)化，酶的推薦反應(yīng)含量為1.25-1.5U（50ul）

模板A的添加量一般在100ng以下。 由于不同類型的DNA模板富集的目的基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進行梯度稀釋，以確定最佳的DNA模板添加量。 如果要進行-PCR反應(yīng)的第二步PCR擴增反應(yīng)，第一步中用作DNA模板的RT反應(yīng)液的量不應(yīng)超過PCR反應(yīng)液總體積的10% 。

此外，即使在質(zhì)粒和探針設(shè)計之后，循環(huán)參數(shù)也已確定，有時需要優(yōu)化。

步驟7：進行數(shù)據(jù)分析時，一般采用不同含量標準樣品的Ct值，形成標準曲線，然后估計相對方程。 方程的斜率可用于檢測PCR的效率。 對于 100% PCR 效率，理想的斜率為 3.32。

最佳標準曲線是在PCR擴增效率90%-100%的基礎(chǔ)上構(gòu)建的（100%是指每個循環(huán)后模板總量會減少到前一個循環(huán)的2倍）。 所有標準曲線的線性回歸分析需要有較高的相關(guān)系數(shù)（R2≥0.99），這樣實驗過程和數(shù)據(jù)才算可信。

使用這個方程我們可以估計未知樣本的模板的初始量。 大多數(shù)定量 PCR 儀器都配有軟件，可以根據(jù)標準曲線手動估計未知樣品的初始模板量。

基本技術(shù)有兩種：絕對定量和相對定量，研究人員需要根據(jù)自己的實驗?zāi)康倪M行選擇。 絕對定量是指將未知樣品與標準曲線進行比較分析。 通常，標準品是已知絕對含量的 DNA 樣本。 需要注意的是，絕對定量分析的準確度是相對于標準品的準確度而言的。

相對定量是指兩個或多個基因相互比較，結(jié)果是百分比，沒有測量確切的數(shù)字。

另外，由于不同樣品的反應(yīng)過程存在一定的差異，因此不僅需要制作標準曲線進行定量，還需要設(shè)計表達水平相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因來標準化結(jié)果。 β-肌動蛋白和甘油醛三乙酸酯酶（-3-、GAPDH）是兩個比較常用的看家基因，此外還有、、β-、β-、等。

應(yīng)該指出的是，該基因可能受到反應(yīng)條件的影響。 在設(shè)計定量表達研究時，保證初始對照基因的質(zhì)量是必要的步驟，嚴謹?shù)难芯咳藛T會對一系列內(nèi)參基因的定量結(jié)果取幾何平均值。 定量數(shù)據(jù)被標準化。

另一個問題是如何區(qū)分獲得的數(shù)據(jù)的優(yōu)劣。 關(guān)于擴增曲線，根據(jù)經(jīng)驗得出：

1、總體來看，曲線拐點明顯，指數(shù)期顯著，擴增曲線整體平行度優(yōu)良，基線平坦且無爬坡現(xiàn)象，低含量樣品擴增曲線顯著處于指數(shù)階段。

2、曲線指數(shù)期的斜率反映了擴增效率，斜率越大，擴增效率越高。 擴增效率越高，試劑靈敏度越好。

3、基線，圖上的基線是陽性樣本的擴增曲線，直線或稍有升高就是好的試劑的性能，陰性和陽性一目了然，不容易誤判。 如果有上升趨勢，可能會導(dǎo)致陽性樣本的誤判。

4、曲線之間的平行性很好，說明各個反應(yīng)管的擴增效率相似，而外標定量是建立在每個管的擴增效率相同的假設(shè)之上的，所以擴增越相似效率越高，定量的重復(fù)性和準確性越好。 無論擴增效率是否相似，擴增曲線上的響應(yīng)就是曲線的平行度。

5、低含量曲線指數(shù)周期顯著，一方面不易出現(xiàn)假陰性、陽性誤判，另一方面表現(xiàn)出較高的靈敏度。

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