PCR是美國科學(xué)家提出的一種快速、大規(guī)模DNA擴(kuò)增的方法，在體外簡化條件下模擬體內(nèi)DNA復(fù)制。 這項(xiàng)技術(shù)榮獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 以待擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物。 在DNA聚合酶的作用下，DNA分子按照半保守復(fù)制機(jī)制沿著模板鏈延伸，直至完成新的DNA。 合成。

——卡里·B.

PCR簡介

PCR反應(yīng)條件

1. PCR反應(yīng)組分

(1) 模板

A。 單鏈和雙鏈 DNA 均可使用

b. 純蛋白、多糖、酚類等抑制PCR反應(yīng)

C。 濃度一般為100ng/100μL。 濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加??。

d. 完整性模板的降解將導(dǎo)致 PCR 擴(kuò)增中沒有產(chǎn)物。

(2)引物

A。 設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)拈L度并避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體。

b. 完整性避免反復(fù)凍融

C。 濃度為0.1-1.0μmol/L。 濃度過高，容易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配，反應(yīng)特異性下降； 如果濃度太低，擴(kuò)增產(chǎn)物就會(huì)太少。

(3) 水

補(bǔ)充系統(tǒng)，保持適當(dāng)?shù)膒H值，避免污染

(4)反應(yīng)

A。 pH、鹽離子、穩(wěn)定劑、增強(qiáng)劑 b． 提供緩沖環(huán)境

(5)鎂2+

A。 濃度0.5-2.5mmol/L，DNA聚合酶激活劑。 濃度過低，Taq酶活性喪失，PCR產(chǎn)率下降； 濃度過高則不專一、嚴(yán)重。

b. 它能與負(fù)離子結(jié)合，因此反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離Mg2+的濃度。

(6)dNTP

A。 濃度一般為20-200μmol/L。 這四種類型應(yīng)該是相等的。 濃度取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的長度。 如果濃度太高，很容易造成錯(cuò)誤堿基的摻入。 如果濃度太低，反應(yīng)收率會(huì)降低。 可與Mg2+結(jié)合，使游離Mg2+濃度降低，影響DNA聚合酶的活性。

b. 避免反復(fù)凍融 (7) Taq DNA 聚合酶

C。 濃度為 0.5-2.5 U/50 μl。 增加酶用量會(huì)降低反應(yīng)特異性； 酶量過少會(huì)影響反應(yīng)收率。

2. PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)

（1）變性——將雙鏈DNA熔解成單鏈——93-95℃，20-30秒——變性溫度低，熔解不完全是PCR實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因

（2）退火——溫度40-60℃，由引物長度和GC含量決定，一般Ta=Tm-3~5℃——提高溫度可以減少引物與模板的非特異性結(jié)合； 降低溫度可以提高反應(yīng)的靈敏度。 -時(shí)間30-60秒

(3)延伸——溫度70-75℃，通常為72℃。 溫度太高不利于引物和模板結(jié)合——時(shí)間由擴(kuò)增片段的長度決定，1kb內(nèi)，1min就夠了，延伸時(shí)間太長會(huì)造成非特異性，但對(duì)于低特異性的擴(kuò)增——濃度模板需要延長時(shí)間。

(4)循環(huán)次數(shù)——主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次——次數(shù)過多：擴(kuò)增效率下降，錯(cuò)摻率增加

PCR引物設(shè)計(jì)

A。 引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。

b. 引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大化擴(kuò)增效率和特異性，同時(shí)最小化非特異性擴(kuò)增。

1. 設(shè)計(jì)原則

首先，該序列應(yīng)位于高度保守的區(qū)域，并且與非擴(kuò)增區(qū)域沒有同源序列。

(1)長度：引物長度一般為15-30 bp，通常為18-24 bp，但擴(kuò)增長片段時(shí)，引物長度為30-35 bp。 ? 引物太短很容易造成錯(cuò)配。 示例：12bp 引物在人類基因組上有 200 個(gè)潛在的退火位點(diǎn)，而 20bp 引物在人類基因組上只有 1/400 個(gè)退火位點(diǎn)。 較長的引物（28-35bp）也常用于區(qū)分同源性較高的模板序列或產(chǎn)生一些突變位點(diǎn)。

(2)GC含量?引物序列的GC含量一般為40-60%。 過高或過低都不利于反應(yīng)的引發(fā)。 上下游引物的GC含量不能相差太大。

(3) 結(jié)構(gòu) ? 盡量避免引物序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，尤其是3'端。 盡量避免引物之間形成二聚體，尤其是 3' 端的前三個(gè)堿基。 避免局部富含GC或AT，并避免3'端出現(xiàn)相同的連續(xù)堿基，例如富含GGG、CCC和AT。

(4) 錯(cuò)配 ? 盡量避免模板上有錯(cuò)配位點(diǎn)的引物。 當(dāng)無法避免不匹配時(shí)，最好不要生產(chǎn)產(chǎn)品。 特別是，3' 端不應(yīng)形成非特異性結(jié)合。 引物3'端存在超過3個(gè)連續(xù)堿基，例如GGG或CCC，也會(huì)增加誤觸發(fā)的可能性。

2、設(shè)計(jì)軟件

?PCR引物設(shè)計(jì)大多通過計(jì)算機(jī)軟件完成。 您可以直接將模板序列提交到特定網(wǎng)頁以獲得設(shè)計(jì)的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件。 引物設(shè)計(jì)需要一定的經(jīng)驗(yàn)，不能僅僅依靠軟件。

?常用軟件

.0（自動(dòng)搜索）*

（底漆評(píng)估）

NTI套裝

歐米茄

（在線服務(wù)）

.0使用介紹

1. .0 下載并安裝。 -sbio.tmmu.com.cn首頁下載中心

2..0使用演示

.0 使用步進(jìn)：

(1) 粘貼序列：復(fù)制序列>File>New>DNA>Ctrl+V，選擇AS為

2. >Sech>設(shè)置引物參數(shù)>OK

3. 搜索完成后，點(diǎn)擊“確定”，選擇符合要求的引物序列。

4. 噴砂檢查引物特異性，必要時(shí)重新設(shè)計(jì)。

.0 評(píng)估入門方法

粘貼序列：復(fù)制序列>File>New>DNA>Ctrl+V，選擇AS為

2.>S>編輯>Ctrl+V>>>確定

3.>A>編輯>Ctrl+V>>>確定

PCR常見問題解答

1.無擴(kuò)增產(chǎn)物

現(xiàn)象：陽性對(duì)照有條帶，而樣品沒有條帶

原因：1.模板：含有抑制劑，含量低

2. 引物：錯(cuò)誤、設(shè)計(jì)不當(dāng)、降解、合成和純化不良

3、反應(yīng)條件：退火溫度不合適、延伸時(shí)間太短、循環(huán)次數(shù)少

對(duì)策：1.純化模板或使用優(yōu)質(zhì)試劑盒提取模板DNA，或增加模板使用量

數(shù)量

2、合成前檢查，重新設(shè)計(jì)，更換管子dnastar引物設(shè)計(jì)，重新合成

3.梯度PCR，延長延伸時(shí)間，增加循環(huán)數(shù)

2. 非特異性擴(kuò)增

現(xiàn)象：條帶與預(yù)期大小不一致或條帶非特異性擴(kuò)增

原因：1、引物特異性差

2.模板或引物濃度過高

3、酶過多

4.Mg2+濃度過高

5、退火溫度低

6、循環(huán)次數(shù)過多

對(duì)策：1.重新設(shè)計(jì)引物或使用巢式PCR

2.適當(dāng)降低模板或引物濃度

3、適當(dāng)減少酶的用量

4.降低鎂離子濃度

5、適當(dāng)提高退火溫度或采用兩段升溫法

6.減少循環(huán)次數(shù)

3. 尾隨

現(xiàn)象：產(chǎn)品在凝膠上呈現(xiàn)涂抹狀

原因：1、模板不純

2.不合適

3、退火溫度低

4、酶過多

5、dNTP、Mg2+濃度過高

6. 循環(huán)次數(shù)已過

對(duì)策：1、凈化模板

2. 更換

3、適當(dāng)減少酶的用量

4.降低dNTP和鎂離子濃度

5、適當(dāng)提高退火溫度

6.減少循環(huán)次數(shù)

4. 污染

現(xiàn)象：目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)在空白對(duì)照中

原因：目標(biāo)序列或擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染

對(duì)策： A. 操作輕柔，防止形成氣溶膠污染； 防止目標(biāo)序列被吸入樣品槍

或從離心管中濺出

b. 試劑應(yīng)先等分，然后低溫保存。

C。 對(duì)耐高溫的試劑或耗材進(jìn)行高壓滅菌

d. 更換實(shí)驗(yàn)室或試劑耗材

提高PCR特異性的方法

A。 巢式 PCR（Nest-PCR）

? 由于目標(biāo)序列與多組引物配對(duì)，減少了擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)的可能性

很少。 提高對(duì)有限數(shù)量的靶序列（例如稀有 mRNA）的靈敏度。增加難度

PCR（例如 5' RACE）特異性困難

?b. 遞減PCR (PCR)

? PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)格的退火條件以增加特異性。循環(huán)設(shè)置

從比估計(jì) Tm 高約 5°C 的退火溫度開始，然后每個(gè)循環(huán)

降低 1-2°C，直到退火溫度低于 Tm 5°C。 ? 最具體的目標(biāo)

模板會(huì)優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物會(huì)在后續(xù)循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增。

根據(jù)優(yōu)點(diǎn)，消減PCR適合那些不了解引物和目標(biāo)模板之間同源程度的人。

高水平的方法比較有用，比如AFLP、DNA指紋分析等。

C。 熱啟動(dòng)PCR（PCR

? 熱啟動(dòng)主要通過抑制重要成分來延遲 DNA 合成，直到

PCR機(jī)達(dá)到變性溫度； 通常選擇熱啟動(dòng)Taq酶； 熱啟動(dòng) PCR 是

除了良好的引物設(shè)計(jì)外，提高PCR特異性的最重要方法之一是

d. PCR增強(qiáng)子

? 甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜堿等可作為PCR的增強(qiáng)劑。

? 可能機(jī)制：增強(qiáng)高GC鏈的熔解，降低熔解溫度，有利于引物

退火有助于DNA聚合酶延伸穿過二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。增強(qiáng)劑的濃度應(yīng)適當(dāng)

什么時(shí)候。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（-PCR）

?結(jié)合RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA聚合酶鏈擴(kuò)增(PCR)的技術(shù)。 首先利用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA合成cDNA，然后以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目標(biāo)片段。

? RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲取目的基因并對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性和半定量分析的最有效方法。

RT

1. RT

? 逆轉(zhuǎn)錄( )

以RNA為模板合成互補(bǔ)DNA的過程。

? 逆轉(zhuǎn)錄酶（RNA 依賴性 DNA 聚合酶）

RNA 指導(dǎo)的 DNA 聚合酶活性

2. RNA水解酶活性

3. DNA引導(dǎo)的DNA聚合酶活性

2. RT反應(yīng)組分

(1)模板組織或培養(yǎng)細(xì)胞RNA

(2) 引物oligo dT、隨機(jī)引物、基因特異性引物

(3) 逆轉(zhuǎn)錄酶AMV、M-MLV、Super-、Quant

(4)RNA酶抑制劑

(5)等底物濃度的四種dNTP

(6) 反應(yīng)環(huán)境緩沖液(RT)

3. RT 引物的選擇

A。 隨機(jī)引物：適用于長RNA或具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，特異性最低。

20 μl 系統(tǒng)中的起始濃度范圍為 50-250 μg。

b. Oligo(dT15-18)：適用于帶PolyA尾的RNA，目標(biāo)片段為

PolyA 在 2kb 以內(nèi)。 20 μl 系統(tǒng)中的起始濃度范圍為 0.2-0.5 μg。

C。 特異性引物：與靶序列互補(bǔ)，是反義寡核苷酸，適合靶序列。

對(duì)于已知條件，20μl 系統(tǒng)中的起始濃度范圍為 1 pmol。

d. RT逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇

? AMV：禽成髓細(xì)胞瘤病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNase H 活性。

最佳溫度為42-60℃。

?MMLV：鼠白血病病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase

H活性較弱。 最佳溫度為37℃或42℃。

? 超級(jí) -：MMLV 反轉(zhuǎn)

轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H 突變體，可轉(zhuǎn)化大部分 RNA

轉(zhuǎn)入cDNA時(shí)，最適溫度為42℃。

?Quant：一種新型高效逆轉(zhuǎn)錄酶，

對(duì)RNA模板親和力強(qiáng)，對(duì)GC含量高的模板讀出效果好

質(zhì)量好，穩(wěn)定，適宜溫度37℃。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法

兩步RT和PCR分別進(jìn)行

同時(shí)進(jìn)行一步 RT 和 PCR

? 兩步法和一步法 RT-PCR 的比較

兩步法 一步法

引物 Oligo dT、隨機(jī)引物、GSP GSP

優(yōu)點(diǎn) ?PCR擴(kuò)增失敗時(shí)易于分析原因； ?特異性高、靈敏度高；

?均在最佳條件下進(jìn)行，反應(yīng)效率高?操作簡便，污染概率低

?cDNA可長期保存

適用于 ? 用于mRNA表達(dá)分析 ? 適用于病毒和病原菌的檢測

?檢測多種靶基因?分析大量樣本

?半定量RT-PCR ?定性

RT-PCR 元件

?分離出高質(zhì)量RNA -純度OD260/280=1.8-2.0； - 1.2甲醛變性凝膠顯示明亮清晰的28S和18S條帶，28S的亮度是18S的兩倍以上； -分離過程中避免RNase污染?使用高活性逆轉(zhuǎn)錄酶，提高逆轉(zhuǎn)錄酶的孵育溫度，減少基因組DNA的污染。

RT-PCR 常見問題解答

1.無擴(kuò)增產(chǎn)物

現(xiàn)象：陽性對(duì)照有條帶，而樣品沒有條帶

原因： A. RNA 降解或起始量較小

b.RNA含有抑制成分

c.cDNA 5'末端不完整

d. 目的基因在組織中不表達(dá)或表達(dá)水平過低。

對(duì)策： A. 分離高質(zhì)量 RNA

b. 使用高溫逆轉(zhuǎn)錄酶

C。 使用隨機(jī)引物或 GSP

d. 嘗試其他組織

2. 非特異性擴(kuò)增

現(xiàn)象：條帶與預(yù)期大小不一致或非特異性擴(kuò)增

原因： A. 基因特異性引物較差

b. 模板和引物的非特異性退火

c.Mg2+濃度過高

d. RNA中存在內(nèi)源或外源DNA污染

e. 引物二聚體的形成

對(duì)策： A. 重新設(shè)計(jì)引物

b. 使用基因特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，或使用 PCR

C。 降低鎂離子濃度

d. 使用擴(kuò)增級(jí)處理過的 RNA，并使用過濾吸頭或引物組

跨內(nèi)含子計(jì)數(shù)。

e. 設(shè)計(jì) 3' 端無互補(bǔ)序列的引物

3. 尾隨

現(xiàn)象：產(chǎn)品在凝膠上呈現(xiàn)涂抹狀

原因：a.cDNA濃度過高

b. DNA 降解時(shí)產(chǎn)生的寡核苷酸的非特異性擴(kuò)增

C。 PCR反應(yīng)中引物過多

d. 循環(huán)次數(shù)太多

e. 退火溫度太低

對(duì)策： A． 減少 cDNA 的用量或增加稀釋倍數(shù)

b. 提取高質(zhì)量 RNA 并設(shè)計(jì)跨越內(nèi)含子的引物，以防止基因組污染。

降低底漆使用效率

C。 優(yōu)化PCR反應(yīng)體系

d. 適當(dāng)提高退火溫度

RT-PCR 應(yīng)用

1. 獲取目的基因

2. RNA 的定性和半定量分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR

常規(guī)PCR是對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析。 起始模板無法準(zhǔn)確定量，擴(kuò)增反應(yīng)無法實(shí)時(shí)檢測。 實(shí)時(shí)PCR是在PCR反應(yīng)體系中添加熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測目的基因的擴(kuò)增情況，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的處理對(duì)起始模板進(jìn)行定性定量分析。

方法介紹

非特異性熒光標(biāo)記： 1. SYBR Green：

特異性熒光標(biāo)記：2.：

3.：

方法一----SYBR綠色法

工作機(jī)制

? SYBR Green 可以結(jié)合雙鏈 DNA 的小溝

? SYBR Green 僅在與雙鏈DNA 結(jié)合后發(fā)出熒光。

? 變性過程中，DNA 雙鏈分離，沒有熒光

? 在復(fù)性和延伸過程中，形成雙鏈DNA，并且SYBR Green 發(fā)出熒光。 在這個(gè)階段

分段收集熒光信號(hào)

優(yōu)勢

? 對(duì)DNA模板無選擇性----適用于任何DNA ?

易于使用 - 無需設(shè)計(jì)復(fù)雜的探頭

非常敏感

便宜的

缺點(diǎn)

? 容易與非特異性雙鏈（如引物聚合物）DNA結(jié)合dnastar引物設(shè)計(jì)，導(dǎo)致假陽性，但

可以通過優(yōu)化反應(yīng)條件來改變，需要熔解曲線

?不支持多種熒光設(shè)計(jì)

方法2----

工作機(jī)制

? 熒光標(biāo)記發(fā)夾探針

? 莖由互補(bǔ)的配對(duì)序列、與靶序列互補(bǔ)的5-7個(gè)核苷酸環(huán)和15-30個(gè)核組成。

分子信標(biāo)會(huì)形成一條鏈，熒光基團(tuán)激發(fā)后產(chǎn)生的光子被該基團(tuán)猝滅。

通過淬滅，熒光團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外線而不是可見光的形式釋放。

優(yōu)勢

? 高特異性，是檢測目標(biāo)序列中SNP最靈敏的試劑之一

? 高靈敏度，可檢測低至1拷貝的核酸

缺點(diǎn)

? 只能用于一種特定目的

?設(shè)計(jì)難點(diǎn)

?價(jià)格相對(duì)較高

方法三----方法

工作機(jī)制

A。 可水解雜交探針與目標(biāo)序列互補(bǔ) ? 5' 端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)

(,R)，例如 FAM?、VIC?、JOE?、NED?、CY3?、CY5?、

德克薩斯紅? 等

b. 3'端標(biāo)記有熒光猝滅基團(tuán)（，Q），例如TAMRA?、MGB

（非）等。 ? 探針完好無損，R 發(fā)出的熒光能量被Q 基團(tuán)吸收。

接收，無熒光； R和Q分離并發(fā)出熒光。 每擴(kuò)增一個(gè) DNA 分子，就會(huì)釋放一個(gè) DNA 分子。

在循環(huán)過程中可以檢測到熒光信號(hào)。 Taq 酶具有 5'→3' 核酸外切酶。

酸酶活性、可水解探針

優(yōu)勢

? a. 目標(biāo)序列高度特異性 ?

b. 設(shè)計(jì)相對(duì)簡單——與目標(biāo)序列的某個(gè)區(qū)域互補(bǔ)。

C。 重現(xiàn)性比較好 ?

d.支持多種熒光設(shè)計(jì)

缺點(diǎn)

?a. 委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高

b. 很難找到低背景的探針

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在科研和臨床中的應(yīng)用

? 定量-DNA 定量

-RNA定量

? 定性SNP 分析

-基因型分析

-RNA變異分析

-熔解曲線分析

- 正負(fù)識(shí)別

實(shí)時(shí) PCR - 定量數(shù)據(jù)處理簡介

1）絕對(duì)定量檢測起始模板數(shù)量的精確拷貝數(shù)，通常使用標(biāo)準(zhǔn)曲線。

A。 至少 5 個(gè)具有不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，覆蓋未知的樣品濃度。

b. 每個(gè)點(diǎn)重復(fù) 3 次

C。 添加 NTC 以檢測可能的污染

d. 將未知樣品的Ct值代入公式，得到起始濃度 X0 2 5

2) 不同處理樣品中目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間基因表達(dá)差異的相對(duì)定量測定

不同的。

(1) 相對(duì)值(ΔCT)——未內(nèi)參基因歸一化——以質(zhì)量單位為標(biāo)準(zhǔn)

– 準(zhǔn)確量化起始材料

(2) 表達(dá)一致——考慮初始樣本的差異——以內(nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)——a

或在所有測試樣本中一致表達(dá)的多個(gè)已知參考基因

競爭性PCR

? 競爭性PCR 是指在同一反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)基因和參考標(biāo)準(zhǔn)。

測試標(biāo)準(zhǔn)用作對(duì)照來估計(jì)特定目標(biāo) DNA 或 RNA 分子的相對(duì)量。

? 競爭PCR有效控制不同反應(yīng)管之間擴(kuò)增效率的差異。

競爭性 PCR - 理論基礎(chǔ)

PCR擴(kuò)增過程中，PCR產(chǎn)物的量用公式Y(jié)=A(1+R)n表示，其中Y代表PCR產(chǎn)物的量，A代表初始模板的量，R代表PCR的擴(kuò)增效率，n代表PCR 當(dāng)PCR擴(kuò)增效率相同時(shí)，PCR產(chǎn)物的量與初始模板的量成正比。 — 相似的基因序列、相同的引物、相同的引物結(jié)合位點(diǎn)、相同的擴(kuò)增效率。 最終混合PCR產(chǎn)物中，待分析樣品與競爭底物最終產(chǎn)物的比例直觀地反映了兩者初始狀態(tài)下核酸含量的比例。

多重+競爭 PCR - 優(yōu)點(diǎn)

A。 高通量：每個(gè)反應(yīng)孔可同時(shí)檢測10個(gè)基因；

b. 經(jīng)濟(jì)：適合大樣本多個(gè)基因同時(shí)檢測，大大縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高

實(shí)驗(yàn)效率。

C。 檢測分辨率高：可有效區(qū)分低至15%的表達(dá)差異；

d. 良好的重現(xiàn)性：在已知濃度的 RNA 增量稀釋后進(jìn)行多重表達(dá)分析

線性關(guān)系良好R2>0.99；

e. 準(zhǔn)確度高：目的/內(nèi)參基因片段與內(nèi)參基因片段序列基本一致

性質(zhì)，確保最終擴(kuò)增產(chǎn)物確實(shí)與初始模板量比例、一個(gè)或多個(gè)參數(shù)發(fā)生反應(yīng)

照明基因和檢測基因在同一管中反應(yīng)，優(yōu)化各基因的表達(dá)水平。

使用競爭性 PCR 進(jìn)行精確測定。

素材來源于網(wǎng)絡(luò)

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