作為一個對微生物基因組了解不多、接觸微生物基因組時間較短的人來說，這樣系統(tǒng)的基因組學自學是一個漫長且極其困難的過程。 寫下這個過程更是痛苦。

但生活中卻有很多令人沮喪的事情。 人無遠慮，必有近憂。 畢竟到了我這個年紀，我的擔心就更多了。

好吧，如果我說太多的話，就會影響我拔劍的速度。

基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、宏基因組學，如果我們想了解分析步驟，就需要了解建庫的原理。 這里我集中講一下二代測序。

基因組學是測量單個基因組，宏基因組學是測量樣本中所有物種的基因組，轉(zhuǎn)錄組是測量mRNA（建庫時使用cDNA）。

根據(jù)我們的分析目的，我們會進行兩種分析，一種是重測序，另一種是從頭測序。

重測序，這些情況對我們來說指的是基因組，我們想知道手頭的樣本的變異情況，就是這樣。

重測序，這些情況都是針對我們沒有參考基因組，需要進行基因組組裝，然后進行基因預測和功能分析。

不過，無論哪種情況，有些步驟是相同的??，那就是登陸數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制。

并且（連接的程序，還有很多其他程序，我用這個來學習，這就是我學到的）

這是一長串圖片，可以幫助我們檢查質(zhì)量。 通常車外數(shù)據(jù)都會有自己的質(zhì)量控制，太差的數(shù)據(jù)不會給客戶dnastar拼接序列，除非客戶數(shù)據(jù)有問題！

基因組測序的解剖

一般來說，最好的方法是二代+三代測序。 三代測序的讀長長，二代測序準確，兩者可以相互校正。

然后我們一般都會見面，更多的是二代測序。 首先，我們描述有參考基因組的情況。

這樣的基因組不需要基因組剪接，直接利用短讀長來繪制參考基因組圖譜。 常用的程序有BWA和2.輸出BAM文件，可視化需要專門的可視化瀏覽器。

只有這個結果才能找到突變位點，SNP，indel，SV等，有些粗糙。 而這個結果還需要進一步解釋，比如編碼區(qū)實際上是否是非編碼區(qū)，在此基礎上還可以做進一步的解釋，比如突變頻率、致病性等，所以挖掘信息的空間是比較大的。

簡單說一下兩種比較程序的區(qū)別：BWA主要用于與參考基因組差異較小的短序列進行比較。 其中，BWA-MEM用于比對測序讀數(shù)或?qū)⑵浣M裝成小型參考基因組，例如人類參考基因組。 該算法對測序錯誤具有良好的穩(wěn)定性，適用的reads寬度范圍廣，從70bp到幾Mb。

是一種超快速且節(jié)省內(nèi)存的工具，用于將測序讀數(shù)與長參考序列進行比對。 適合比對約 50 至 100 個堿基的讀數(shù)。

現(xiàn)在我們來說說沒有參考基因組的情況。

在沒有參考基因組的情況下，如果我們想要挖掘信息，就需要重新組裝基因組。 從頭開始拼接的程序有很多，ABySS、Flye等等。

這是我的總結：

拼接策略

算法

優(yōu)勢

深淵

盛開

增加了整體視頻內(nèi)存要求，以允許組裝小基因組。

圖形

處理和數(shù)據(jù)、使用和讀取的能力提供了混合組件。 它專為小基因組而設計，允許組裝單細胞 MDA 數(shù)據(jù)以及標準分離株。

弗萊

圖形，

用于單分子測序讀取的從頭組裝程序，例如 和 。 適用于各種數(shù)據(jù)集，從大型真菌項目到小型飼養(yǎng)廠組件。

組裝的序列可以直接用于預測基因和進行功能分析嗎？

不，還有兩個步驟，修正（針對三代：Pilon）和去重復序列（）！

重復序列存在于多種物種中。 重復序列在真核基因組中更為豐富，例如，人類基因組的 47% 被認為由重復序列組成。 識別并掩蓋重復且低復雜性的 DNA 序列，以改進下游基因預測。

別問我重復序列是什么，又是一個短篇故事，我們放張圖吧！

一般來說，對于重復的序列，不是直接刪除，而是屏蔽掉，比如將序列改為大寫。

屏蔽重復序列，好吧，出來進行基因預測。

這里分為真核基因預測和原核基因預測：

真核基因預測： .

是一種基于廣義隱馬爾可夫模型的真核生物基因預測軟件工具。 為了預測基因組序列中不同區(qū)域和信號的統(tǒng)計特征，如內(nèi)含子、編碼外顯子、UTR、啟動子等。

包括100多個物種的預訓練模型，如果分析的真核生物沒有模型，則需要對模型進行訓練，即需要將RNA-Seq、蛋白質(zhì)、EST/cDNA等外部證據(jù)數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)進行訓練。已上傳。 提示是關于基因位置和結構的外在證據(jù)。 每個提示都是與特定基因組區(qū)域相關的本地信息。 在預測基因時，可以合并此類提示，這將改變候選基因結構的可能性。

它會傾向于預測與提示一致的基因結構。 輸出結果包括三部分， 1. GFF 格式的預測基因組特征的坐標。 包含基因、轉(zhuǎn)錄本、內(nèi)含子、起始密碼子、終止密碼子和CDS信息。 2.CDS序列：包含預測基因編碼區(qū)核酸序列的序列表。 3.蛋白質(zhì)序列：包含預測基因的蛋白質(zhì)序列的序列表。

原核基因預測：

基于注冊馬爾可夫模型，它已成功用于尋找代表數(shù)百個物種的真菌、古細菌和病毒中的基因。 結果包括序列表，其中包含預測基因的核酸序列。 序列名稱對應于行加上基因名稱。

GFF3格式：在這里可以看到GFF文件的結果，包括序列ID、預測類型、起始和結束位置、正鏈和負鏈條件。

和常用工具一樣，可以對剪接預測后的數(shù)據(jù)進行功能分析，比如蛋白質(zhì)功能比對、GO注釋、注釋以及KEGG通路注釋等。最后講到功能分析的時候再一起講。

對于基因組組裝序列或者框架圖或者僅僅是高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，我們可以在此基礎上進行MLST分型。

MLST 是研究重要公共衛(wèi)生支原體物種遺傳多樣性的有用工具，提供了便攜式且可重復的分型系統(tǒng)。 它是一種基于核酸序列的方法，通常使用七個管家基因的內(nèi)部片段序列來表征真菌分離株。 （需要選擇參考物種、MLST 等位基因序列和從 .org 獲得的概況數(shù)據(jù)）。

說了這么多基因組數(shù)據(jù)，我們來說說轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

當我們進行轉(zhuǎn)錄組測序時，我們會測量此時細胞中的所有 mRNA 轉(zhuǎn)錄。

1. 對測序樣本進行質(zhì)量控制，過濾reads，剔除低質(zhì)量核苷酸。 與基因組相同，跳過。

轉(zhuǎn)錄組有一個參考基因組（你可以選擇幾個參考基因組進行分析，對嗎？）

與基因組參考類似，過濾后的讀數(shù)直接與參考基因組進行比較（比較軟件：STAR 和 BWA）。

STAR 用于比對小基因組，并有可能精確比對第三代測序技術中出現(xiàn)的長（數(shù)千個核苷酸）讀取。 BWA適合簡單的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較，例如真菌。 由于STAR支持剪接位點和融合reads檢查，結果不僅統(tǒng)計匹配的reads、剪接位點的數(shù)量和類型，還統(tǒng)計錯位、插入和gap統(tǒng)計。

比較結果是Bam文件。 統(tǒng)計與基因組比對的Reads分布，定位區(qū)域分為CDS（編碼區(qū)）、（內(nèi)含子）、（基因間區(qū)）和UTR（5'和3'非翻譯區(qū)）。 在基因組注釋相對完整的物種中，與CDS（編碼區(qū)）對齊的reads濃度一般是最高的。 與（內(nèi)含子）區(qū)域?qū)R的讀數(shù)源自前mRNA殘基或發(fā)生在選擇性剪接過程中。由內(nèi)含子引起的內(nèi)含子保留干擾，以及與（基因間區(qū)域）對齊的讀數(shù)可能是從新基因或新的非基因轉(zhuǎn)錄的。編碼RNA。

如果沒有參考基因組，則需要組裝轉(zhuǎn)錄本 (?)。

用于轉(zhuǎn)錄組組裝的組裝軟件，基于DBG（De）組裝原理組裝出高質(zhì)量的序列。

1）：借助高質(zhì)量序列建立K-mer寬度的短序列庫，然后通過短序列之間的K-mer-1寬度延伸短序列，得到初步的拼接序列

2）：通過序列降維，然后為每個類創(chuàng)建一個圖

3）：處理圖，根據(jù)圖中的Reads和配對的Reads找到路徑，得到轉(zhuǎn)錄本

PMID 的：

雖然這個地方，拼接的結果有轉(zhuǎn)錄本/異構體。

我個人的理解：轉(zhuǎn)錄本是一個基因的多個轉(zhuǎn)錄本。

異構體，與該轉(zhuǎn)錄本對應的不同蛋白質(zhì)（并非所有轉(zhuǎn)錄本都會被翻譯。）

不過我看文獻，據(jù)說是抄本拼接體……

剪接的下一步是進行完整性評估（BUSCO），顧名思義，即根據(jù)單拷貝基因來評估剪接結果的質(zhì)量。

一般情況下，剪接后會進行基因預測，針對編碼區(qū)（這里指的是ORF，ORF不是基因，也不是外顯子）來預測轉(zhuǎn)錄組。

這里我也說一下CDS、ORF、外顯子的區(qū)別，因為我老是犯錯誤：

CDS：CDS 是翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)的 DNA 實際區(qū)域。 在原核生物中，ORF和CDS是相同的。

ORF：ORF 是一種 DNA 序列，以起始密碼子“ATG”（并非總是）開始，以三個終止密碼子（TAA、TAG、TGA）中的任何一個結束。 根據(jù)出發(fā)點，根據(jù)遺傳密碼將任何堿基序列翻譯成多肽序列有六種可能的形式（正鏈上三種，互補鏈上三種），稱為閱讀框。 可能含有內(nèi)含子。 CDS一定是ORF，而ORF不一定是CDS。

外顯子：外顯子是基因的任何部分，通過 RNA 剪接去除內(nèi)含子后，將產(chǎn)生基因最終成熟 RNA 的該部分。 （摘自網(wǎng)絡解釋）

這是我在網(wǎng)上找到的兩張圖片，大家看一下。

我的理解是：ORF是多肽序列對應的mRNA或DNA序列，也就是說從起始密碼子到終止密碼子的mRNA序列（從mRNA上的AUG開始到終止密碼子結束，或者DNA序列從 ATG 開始，以 TAA、TAG、TGA 結束）。 之后它可能包含內(nèi)含子。 這是ORF，ORF可以翻譯成蛋白質(zhì)序列，所以這個ORF可能是一個基因，前一個基因的一部分，所以ORF越長越好。

成熟的 mRNA 剪接內(nèi)含子，留下外顯子（富含 5' 和 3' 非翻譯區(qū)。）

因為CDS是只能翻譯多肽的序列，所以不等于外顯子。 就這樣。

在轉(zhuǎn)錄組的編碼區(qū)預測中，將輸出GFF格式的預測CDS、預測蛋白和預測編碼區(qū)坐標。

在進行下一步分析之前，會進行一個去冗余步驟，這里提到的是CD-HIT得到代表序列()。

接下來就是轉(zhuǎn)錄組分析最常見、最重要的目的——差異基因分析。

第一個是定量的。

對于參考基因組，可以使用 HTSeq 包。 采用HTSeq統(tǒng)計比較各基因的值，作為該基因的原始表達量。 讀取計數(shù)與基因的真實表達水平以及基因的寬度和測序深度呈正相關。

這里將 BAM/SAM 文件與 GFF/GTF 注釋參考文件進行比較。

下面是讀取特征的方式，即這些比較的就認為是比較的，那些比較的就認為不是比較的，通常按照Union方案來統(tǒng)計。

在沒有基因組的情況下，轉(zhuǎn)錄本序列只能作為參考，將每個樣本的與參考序列進行比較，利用軟件RSEM獲得統(tǒng)計結果。

規(guī)劃工作完成后，下一步就是進行不同的表達分析（針對給出的中學策略）。

得到的MA圖、火山圖、MDS圖、熱力圖都是不同的表達可視化圖，就不贅述了。

同樣的，我們也可以對差異基因進行富集分析，上面也提到了。

這里順便說一下三代轉(zhuǎn)錄組測序（）。 由于三代reads較長，請勿拼接。

：每次測序運行均由 ccs 軟件處理，為每個 ZMW（零模式波導）生成代表性的 CCS。

質(zhì)粒清理和復用：使用 lima 執(zhí)行質(zhì)粒清理和條形碼調(diào)用。

細化：此步驟包括 Poly(A) 尾部修剪以及多聯(lián)體識別和去除。

降維：

（選修的）：

剩下的就和二代分析差不多了，定量，分析……

宏基因組學

我想研究沉積物的人應該對此很熟悉。

我們收到離面數(shù)據(jù)后，首先進行質(zhì)檢和拼接。 在獲得高質(zhì)量的序列后dnastar拼接序列，如果我們在進行宿主相關的研究，一般需要從測序數(shù)據(jù)中分離出宿主相關的DNA。

在自然環(huán)境中觀察到的真菌中，只有不到 1% 可以在正常實驗室條件下培養(yǎng)，這使得絕大多數(shù)真菌難以用傳統(tǒng)微生物程序進行研究。 宏基因組學是將測序技術應用于自然環(huán)境中微生物群落的 DNA，從而測量此類樣本中微生物及其基因的整體多樣性。

宏基因組學實驗的第一個主要目標通常是測量和量化存在的微生物。 這個過程稱為分類分類或分析。 評估樣本分類組成的主要策略有兩種：擴增子測序 (16S/18S/ITS) 和全基因組測序 (WGS)。 擴增子測序分析雖然成本較低，但也有一些局限性，并且在某些真菌物種中，它們的 rRNA 基因之間沒有足夠的差異，無法進行物種鑒定。 宏基因組測序是來自整個樣本群落的所有基因組信息，也可以識別物種。

分類

簡而言之，通過物種組成進行 OTU 分類和產(chǎn)量分析。

宏基因組組裝：

拼接策略

算法

優(yōu)勢

德圖

大型基因組設計需要更多的資源并花費更多的時間，但也會帶來更好的結果，即更高的 Nx 值。

德圖

用于以省時且經(jīng)濟高效的方式組裝小型且復雜的宏基因組數(shù)據(jù)。

宏基因組基因預測：

是一個用于在短讀段中查找（片段化）基因的應用程序。 它還可用于預測不完整組裝或完整基因組中的原核基因。

是一款用于真菌和古細菌基因組蛋白質(zhì)編碼基因預測的軟件。

結果輸出：

接下來是功能分析：

-和

借助史密斯比對算法對旁系同源基因簇進行了功能注釋。 旁系同源基因是指由于物種產(chǎn)生的進化過程而在不同個體中形成的同源基因。 這個基因起源于一個共同的祖先； 因此，在進化過程中，旁系同源基因一般都保留著相同或相似的特征。 - 是一種使用基于正交分配的預先估計快速對新序列（基因或蛋白質(zhì)）進行功能注釋的工具。

輸入帶有分析的序列（可以是蛋白質(zhì)序列和基因組序列），蛋白質(zhì)序列用于在整理數(shù)據(jù)庫中搜索，猜測同源蛋白質(zhì)，功能注釋（參考鏈接：）。

輸出結果還包括 GO 注釋的鏈接。

Pfam 是一種廣泛使用的蛋白質(zhì)家族域數(shù)據(jù)庫，它依靠多重序列比對和隱馬爾可夫模型 (HMM) 來識別一個或多個蛋白質(zhì)功能域。 它是一個蛋白質(zhì)比較工具。

宏基因組樣本的比較與分析（分類產(chǎn)量比較和功能差異產(chǎn)量分析）

注釋差異分析

差異產(chǎn)量分析

功能差異產(chǎn)量分析

接下來詳細說一下功能分析，即用于功能注釋和序列數(shù)據(jù)分析。 主要是技巧。 通過提取與獲得的命中相關的 GO 術語并返回查詢序列來評估 GO 注釋。 酶代碼是從等效的 GO 圖譜中獲得的，而基序是直接在 . GO注釋可以通過重建基因本體關系和通路結構來可視化。 主要包括5個步驟：、、標注、統(tǒng)計分析和可視化。

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