PCR是法國(guó)科學(xué)家Mulis在體外簡(jiǎn)化條件下模擬體內(nèi)DNA復(fù)制而提出的一種快速、大規(guī)模的DNA擴(kuò)增方法。 這項(xiàng)技術(shù)獲得了1993年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。 以待擴(kuò)增的DNA分子為模板，與模板互補(bǔ)的一對(duì)寡核苷酸片段為質(zhì)粒，在DNA聚合酶的作用下，按半保守復(fù)制的機(jī)制沿模板鏈延伸，直至合成新的DNA完成了 。

——Kary B.

1個(gè)

聚合酶鏈反應(yīng)簡(jiǎn)介

PCR反應(yīng)條件

1. PCR反應(yīng)組分

(1)模板

A。 單鏈和雙鏈DNA均可使用

b. 純化的蛋白質(zhì)、多糖、酚類(lèi)等抑制PCR反應(yīng)

C。 濃度通常為100ng/100μL，太低會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增減少

d. 完整模板的降解會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物

(2) 質(zhì)粒

A。 設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)膶挾纫员苊舛?jí)結(jié)構(gòu)和二聚體

b. 完整性防止反復(fù)冷凍和解凍

C。 濃度為0.1-1.0μmol/L。 含量過(guò)低，易造成模板與質(zhì)粒錯(cuò)配，反應(yīng)特異性增加； 如果含量太低，擴(kuò)增產(chǎn)物就會(huì)太少。

(3) ddH2O

補(bǔ)充體系，pH值適宜，防止污染

(4) 反應(yīng)

a、pH、鹽離子、穩(wěn)定劑、增強(qiáng)劑 b、提供緩沖環(huán)境

(5) 鎂2+

A。 濃度0.5-2.5mmol/L，DNA聚合酶激活劑。 含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致Taq酶活性喪失，PCR產(chǎn)值升高； 如果含量太低，則不具體且嚴(yán)重。

b. 能與負(fù)離子結(jié)合，因此反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的含量影響反應(yīng)中游離Mg2+的含量。

(6) dNTPs

A。 濃度通常為20-200μmol/L，四者應(yīng)相等。 含量取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的寬度。 如果含量太低，容易造成錯(cuò)誤的核苷酸摻入。 含量過(guò)高會(huì)降低反應(yīng)產(chǎn)值，可與Mg2+合用。 增加游離Mg2+含量，影響DNA聚合酶活性。

b. 避免反復(fù)凍融 (7) 聚合酶

C。 濃度為0.5-2.5U/50μl，酶量的減少會(huì)增加反應(yīng)的特異性； 酶量過(guò)少會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)值。

2. PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)

(1)變性——雙鏈DNA熔解成單鏈——93-95℃，20-30秒——變性溫度低，熔解不完全是PCR實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因

(2)固溶-濕度40-60°C，由質(zhì)粒寬度和GC濃度決定，通常Ta=Tm-3~5°C-降低體溫可減少非特異性結(jié)合質(zhì)粒到模板； 升高體溫可降低反應(yīng)的敏感性。 - 時(shí)間 30-60 秒

(3)延伸——溫度70-75℃，一般72℃，濕度太低不利于質(zhì)粒與模板結(jié)合——時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段的粗細(xì)而定，1kb以?xún)?nèi)， 1min就夠了，延伸時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)造成非特異性，但對(duì)于低含量模板的擴(kuò)增需要延長(zhǎng)時(shí)間。

(4)循環(huán)次數(shù)——主要取決于模板DNA的含量，一般為25-35次——過(guò)多：擴(kuò)增效率提高，錯(cuò)誤摻入率降低

PCR質(zhì)粒設(shè)計(jì)

A。 引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。

b. 引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大化擴(kuò)增效率和特異性； 同時(shí)最大限度地減少非特異性擴(kuò)增。

一、設(shè)計(jì)原則

首先，該序列應(yīng)位于高度保守的區(qū)域，與非擴(kuò)增區(qū)域沒(méi)有同源序列。

(1)寬度?質(zhì)粒的厚度通常為15-30bp，一般為18-24bp，但擴(kuò)增長(zhǎng)片段時(shí)，質(zhì)粒的寬度為30-35bp。 ?過(guò)短的質(zhì)粒容易造成錯(cuò)配。 例子：一個(gè)12bp的質(zhì)粒在人類(lèi)基因組上有200個(gè)潛在的固溶位點(diǎn)，而一個(gè)20bp的質(zhì)粒在人類(lèi)基因組上只有1/400個(gè)固溶位點(diǎn)。 較長(zhǎng)的質(zhì)粒（28-35bp）常用于區(qū)分同源性較高的模板序列或形成一些突變位點(diǎn)。

(2) GC濃度?質(zhì)粒序列的GC濃度通常為40-60%dnastar引物設(shè)計(jì)，過(guò)低或過(guò)高都不利于引起反應(yīng)。 上游和下游質(zhì)粒的 GC 濃度不應(yīng)相差太大。

(3) 結(jié)構(gòu)?盡量避免質(zhì)粒序列產(chǎn)生，尤其是3'端。 盡量避免質(zhì)粒之間的二聚體，尤其是 3' 端的前 3 個(gè)核苷酸之間。 避免部分含有GC或AT，避免3'端連續(xù)相同的核苷酸，如GGG、CCC、。

(4) 錯(cuò)配? 盡量避免質(zhì)粒模板上的錯(cuò)配位點(diǎn)。 當(dāng)不防止錯(cuò)配時(shí)，優(yōu)選不形成產(chǎn)物。 特別是 3' 端不應(yīng)產(chǎn)生非特異性結(jié)合。 質(zhì)粒3'端連續(xù)3個(gè)以上的核苷酸，如GGG或CCC，也會(huì)降低出錯(cuò)的概率。

2.設(shè)計(jì)軟件

?PCR質(zhì)粒設(shè)計(jì)主要通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行。 您可以直接將模板序列提交至特定網(wǎng)頁(yè)獲取設(shè)計(jì)好的質(zhì)粒，也可以在本地電腦上運(yùn)行專(zhuān)業(yè)的質(zhì)粒設(shè)計(jì)軟件。 質(zhì)粒設(shè)計(jì)需要一定的經(jīng)驗(yàn)，不能單靠軟件。

?常用軟件

.0（手動(dòng)搜索）*

（質(zhì)粒評(píng)價(jià)）

西裝

奧米加

（在線服務(wù)）

.0 使用介紹

1..0 下載并安裝。 -sbio.tmmu.com.cn首頁(yè)下載中心

2..0演示

.0 使用步驟：

(1) 粘貼序列：復(fù)制序列>文件>新建>DNA>Ctrl+V，選擇ASis

2.>搜索>設(shè)置質(zhì)粒參數(shù)>確定

3. 搜索完成后，點(diǎn)擊確定，選擇符合要求的質(zhì)粒序列。

4. Blast 檢測(cè)質(zhì)粒特異性，必要時(shí)重新設(shè)計(jì)。

.0 評(píng)估質(zhì)粒方式

粘貼序列：復(fù)制序列>文件>新建>DNA>Ctrl+V，選擇ASis

2.>S>編輯>Ctrl+V>>>確定

3.>A>編輯>Ctrl+V>>>確定

關(guān)于 PCR 的常見(jiàn)問(wèn)題

1.無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物

現(xiàn)象：陽(yáng)性對(duì)照有條帶，樣品無(wú)條帶

原因：1、模板：含有豐富的抑制劑，濃度低

2. 質(zhì)粒：錯(cuò)誤、設(shè)計(jì)不當(dāng)、降解、合成和純化不良

3、反應(yīng)條件：固溶溫度不合適，延伸時(shí)間太短，循環(huán)次數(shù)少

對(duì)策：1、純化模板或使用優(yōu)質(zhì)試劑盒提取模板DNA，或強(qiáng)化模板

數(shù)量

2. 合成前檢測(cè)，重新設(shè)計(jì)，更換管子，重新合成

3.梯度PCR，延長(zhǎng)延伸時(shí)間，增加循環(huán)次數(shù)

2. 非特異性擴(kuò)增

現(xiàn)象：條帶與預(yù)期大小不符或非特異性擴(kuò)增條帶

原因：1、質(zhì)粒特異性差

2.模板或質(zhì)粒含量過(guò)低

3、酵素過(guò)多

4、Mg2+含量過(guò)高

5、固溶體溫度過(guò)高

6. 循環(huán)太多

對(duì)策：1.重新設(shè)計(jì)質(zhì)粒或使用巢式PCR

2.適當(dāng)增加模板或質(zhì)粒含量

3、適當(dāng)減少酶的用量

4.增加鎂離子含量

5、適當(dāng)增加固溶濕度或采用兩段升溫法

6.減少循環(huán)次數(shù)

3.尾隨

現(xiàn)象：產(chǎn)品在凝膠上呈涂抹狀

原因：1.模板不純

2.不適合

3、固溶體溫度過(guò)高

4、酵素過(guò)多

5、dNTP和Mg2+含量過(guò)高

6.循環(huán)次數(shù)過(guò)高

對(duì)策：1.凈化模板

2.更換

3、適當(dāng)減少酶的用量

4.增加dNTP和鎂離子含量

5、適當(dāng)提高固溶溫度

6.減少循環(huán)次數(shù)

4.污染

現(xiàn)象：目的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)在空白對(duì)照中

原因：目標(biāo)序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

對(duì)策： 操作溫和，避免氣溶膠污染； 避免將目標(biāo)序列吸入采樣槍

或飛濺出離心管

b. 試劑應(yīng)先包裝，再高溫保存

C。 低溫高壓滅菌試劑或耗材

d. 更換實(shí)驗(yàn)室或試劑耗材

增強(qiáng) PCR 特異性的方法

A。 巢式PCR

?增加擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)的可能性，由于目標(biāo)序列與多組質(zhì)粒配對(duì)

很少。 對(duì)有限量的目標(biāo)序列（如稀有 mRNA）的敏感性降低。提高困倦

困難的 PCR（例如 5'RACE）特異性

?b、降序聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

?PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)格的固溶條件以提高特異性。loop set

從比計(jì)算的 Tm 高約 5°C 的溶液溫度開(kāi)始，然后每個(gè)循環(huán)

增加1-2°C直到固溶溫度比Tm高5°C。 ?特異性最高的目標(biāo)

模板將被優(yōu)先擴(kuò)增，該產(chǎn)物將在后續(xù)循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增。

根據(jù) . PCR 對(duì)那些不知道質(zhì)粒和目標(biāo)模板之間同源性程度的人很有用。

度數(shù)高的方法比較有用，比如AFLPdnastar引物設(shè)計(jì)，DNA指紋等。

C。 熱啟動(dòng) PCR（PCR

?熱啟動(dòng)主要通過(guò)抑制一種堿性成分來(lái)延緩DNA合成，直到

PCR儀達(dá)到變性溫度； 一般選用熱啟動(dòng)Taq酶； 熱啟動(dòng) PCR 是

除了良好的質(zhì)粒設(shè)計(jì)，提高PCR特異性的最重要途徑之一

d. PCR增強(qiáng)子

?甲基丙基酯、DMSO、甘油、馬鈴薯堿等均可作為PCR增強(qiáng)劑。

?可能的機(jī)制：加強(qiáng)GC高鏈的熔解，提高熔解溫度，有利于引物

固溶體，有助于DNA聚合酶延伸通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。增強(qiáng)子的含量應(yīng)適當(dāng)

什么時(shí)候。

2個(gè)

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (-PCR)

? 一種將RNA 逆轉(zhuǎn)錄(RT) 與cDNA 聚合酶鏈擴(kuò)增(PCR) 相結(jié)合的技術(shù)。 首先，在逆轉(zhuǎn)錄酶的幫助下，由RNA合成cDNA，然后以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。

? RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲取目的基因，對(duì)序列已知的RNA進(jìn)行定性和半定量分析的最有效方法。

轉(zhuǎn)播

1. 轉(zhuǎn)發(fā)

?反轉(zhuǎn)錄()

以RNA為模板合成與RNA互補(bǔ)的DNA的過(guò)程。

? 逆轉(zhuǎn)錄酶（RNA 依賴(lài)性 DNA 聚合酶）

RNA 指導(dǎo)的 DNA 聚合酶活性

2. RNA酯酶活性

3. DNA 定向 DNA 聚合酶活性

2. RT 反應(yīng)組分

(1)模板組織或培養(yǎng)細(xì)胞RNA

(2) 質(zhì)粒、隨機(jī)質(zhì)粒、基因特異性質(zhì)粒

(3)逆轉(zhuǎn)錄酶AMV、M-MLV、Super-、Quant

(4) 核糖核酸酶抑制劑

(5) 四種底物含量相等的dNTPs

(6) 反應(yīng)環(huán)境緩沖液（RT）

3. RT 質(zhì)粒的選擇

A。 隨機(jī)質(zhì)粒：適用于特異性最低的長(zhǎng)RNA或發(fā)夾RNA。

在 20μl 系統(tǒng)中起始含量范圍為 50-250μg。

b. Oligo(dT15-18)：適用于帶PolyA尾的RNA，目標(biāo)片段距離

polyA 在 2 kb 以?xún)?nèi)。 在 20μl 系統(tǒng)中起始濃度范圍為 0.2-0.5μg。

C。 特異性質(zhì)粒：與靶序列互補(bǔ)，是反義寡核苷酸，適合靶序列

對(duì)于已知情況，起始含量范圍為 20μl 系統(tǒng)中的 1pmol。

d. RT逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇

? AMV：禽成髓細(xì)胞增多癥病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNase H 活性。

最佳溫度為42-60°C。

? MMLV：鼠癌病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase

H活性弱。 最佳溫度為 37°C 或 42°C。

? 超：MMLV 反轉(zhuǎn)

轉(zhuǎn)化大部分 RNA 的轉(zhuǎn)錄酶的 突變體

轉(zhuǎn)化為cDNA，最適溫度為42℃。

?Quant：一種新型高效逆轉(zhuǎn)錄酶，

與RNA模板親和力強(qiáng)，研究對(duì)高GC濃度模板的療效

好，品質(zhì)穩(wěn)定，最佳溫度37℃。

RT-PCR方法

兩步法 RT 和 PCR 分別進(jìn)行

同時(shí)一步 RT 和 PCR

? 兩步和一步 RT-PCR 的比較

兩步法 一步法

質(zhì)粒，隨機(jī)質(zhì)粒，

優(yōu)點(diǎn) ? 易于分析PCR擴(kuò)增失敗的原因。 ? 高特異性和敏感性；

?分別在最佳條件下進(jìn)行，反應(yīng)效率高?操作簡(jiǎn)單，污染概率低

? cDNA可全年保存

適用 ? 用于mRNA表達(dá)分析 ? 適用于病毒和病原體檢測(cè)

?多個(gè)目標(biāo)基因的監(jiān)測(cè) ?大量樣本的分析

?半定量RT-PCR?定性

RT-PCR元件

?分離優(yōu)質(zhì)RNA-含量OD260/280=1.8-2.0；-完整性1.2甲醛變性凝膠顯示28S和18S條帶明亮清晰，28S色溫是18S的兩倍以上；-防止RNase污染分離時(shí)? 使用高活性逆轉(zhuǎn)錄酶? 提高逆轉(zhuǎn)錄酶保溫溫度? 減少基因組DNA污染

RT-PCR 常見(jiàn)問(wèn)題

1.無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物

現(xiàn)象：陽(yáng)性對(duì)照有條帶，樣品無(wú)條帶

原因： A. RNA 降解或初始量低

b. RNA含有抑制成分

C。 cDNA 5'端不完整

d. 目的基因未表達(dá)或在組織中表達(dá)量過(guò)低

對(duì)策： 分離高質(zhì)量的RNA

b. 使用低溫逆轉(zhuǎn)錄酶

C。 使用隨機(jī)質(zhì)?；?GSP

d. 嘗試其他組織

2. 非特異性擴(kuò)增

現(xiàn)象：條帶與預(yù)期大小不符或非特異性擴(kuò)增

原因： A. 弱基因特異性質(zhì)粒

b. 模板與質(zhì)粒之間的非特異性固溶體

C。 Mg2+含量過(guò)高

d. RNA 中的內(nèi)源性或外源性 DNA 污染

e. 質(zhì)粒二聚體的產(chǎn)生

對(duì)策： 重新設(shè)計(jì)質(zhì)粒

b. 使用基因特異性質(zhì)?；?PCR 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄

C。 增加鎂離子含量

d. 使用帶過(guò)濾吸頭的放大級(jí)處理過(guò)的 RNA，或質(zhì)粒組

計(jì)數(shù)跨越內(nèi)含子。

e. 設(shè)計(jì) 3' 端無(wú)互補(bǔ)序列的引物

3.尾隨

現(xiàn)象：產(chǎn)品在凝膠上呈涂抹狀

原因： A. cDNA含量太低

b. DNA 降解時(shí)形成的寡核苷酸的非特異性擴(kuò)增

C。 PCR 反應(yīng)中的質(zhì)粒過(guò)多

d. 循環(huán)次數(shù)太少

e. 固溶溫度過(guò)高

對(duì)策： 減少 cDNA 的用量或降低稀釋倍數(shù)

b. 提取優(yōu)質(zhì)RNA，質(zhì)粒設(shè)計(jì)跨越內(nèi)含子，避免基因組污染

質(zhì)粒使用效率降低

C。 優(yōu)化PCR反應(yīng)體系

d. 適當(dāng)提高固溶溫度

RT-PCR應(yīng)用

1. 獲取目的基因

2. RNA定性和半定量分析

3個(gè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（）

常規(guī)PCR是對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的末端產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析。 起始模板的精確量化是不可能的，擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)也是不可能的。 Real-time PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光功能基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累技術(shù)實(shí)時(shí)檢測(cè)目的基因擴(kuò)增，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的處理對(duì)初始模板進(jìn)行定性和定量分析.

方式介紹

非特異性熒光標(biāo)記： 1. ：

特異性熒光標(biāo)記： 2.:

3.:

方法 1 - 方法

工作機(jī)制

?可以結(jié)合雙鏈DNA的小溝

? 只有在與雙鏈 DNA 結(jié)合時(shí)才會(huì)發(fā)出熒光

?變性時(shí)，DNA雙鏈分離，無(wú)熒光

? 在重折疊和延伸過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生雙鏈 DNA，此時(shí) 會(huì)發(fā)出熒光

熒光信號(hào)

優(yōu)勢(shì)

? DNA模板無(wú)選擇性——適用于任何DNA?

易于使用 - 無(wú)需設(shè)計(jì)復(fù)雜的探頭 ?

非常敏感

負(fù)擔(dān)得起的

缺點(diǎn)

? 容易與非特異性雙鏈（如質(zhì)粒聚集體）DNA結(jié)合，造成假陰性，但

可以通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件來(lái)改變，需要熔體曲線

? 不支持多熒光設(shè)計(jì)

方法二----

工作機(jī)制

?標(biāo)記熒光頭套探頭

?莖由與目標(biāo)序列互補(bǔ)的5-7個(gè)堿基環(huán)和15-30個(gè)核心組成的互補(bǔ)配對(duì)序列組成

核酸，分子信標(biāo)會(huì)支化，熒光側(cè)鏈斷裂后形成的光子被官能團(tuán)猝滅

隨著猝滅，熒光復(fù)合物形成的能量以紅外線而不是可見(jiàn)光的形式釋放。

優(yōu)勢(shì)

? 特異性高，是檢測(cè)目標(biāo)序列中SNP最靈敏的試劑之一

? 靈敏度高，低至1個(gè)核苷酸拷貝均可測(cè)量

缺點(diǎn)

? 只能用于一個(gè)特定目的

? 設(shè)計(jì)難度大

? 價(jià)格相對(duì)較高

方法 3 - 方法

工作機(jī)制

A。 酯化雜交探針與靶序列互補(bǔ)。 5'端標(biāo)有報(bào)告功能團(tuán)

(,R)，例如 FAM?、VIC?、JOE?、NED?、CY3?、CY5?，

德州紅?等

b. 3'端標(biāo)記有熒光猝滅復(fù)合物（,Q），如TAMRA?、MGB

(non-)等 探針完整，R發(fā)出的熒光能量被Q官能團(tuán)吸收

收到，無(wú)熒光； R 和 Q 分離，發(fā)熒光 ? 對(duì)于每個(gè)擴(kuò)增的 DNA 分子，一個(gè)

可在循環(huán)過(guò)程中測(cè)量的熒光信號(hào) ? Taq 酶具有 5'→3' 外切核小體

酸酶活性，酯化探針

優(yōu)勢(shì)

? 一個(gè)。 對(duì)目標(biāo)序列的高度特異性

b. 設(shè)計(jì)比較簡(jiǎn)單------與目標(biāo)序列的某個(gè)區(qū)域互補(bǔ) ?

C。 良好的重復(fù)性 ?

d. 支持多種熒光設(shè)計(jì)

缺點(diǎn)

? 一個(gè)。 委托公司做標(biāo)，價(jià)格更高

b. 不容易找到背景低的探針

Real-time PCR在科研和臨床應(yīng)用中的應(yīng)用

? 量化——DNA 量化

- RNA 定量

? 定性 SNP 分析

- 基因型分析

-RNA變異分析

- 熔解曲線分析

- 消極和積極的認(rèn)同

實(shí)時(shí)PCR-定量數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)介

1) 起始模板編號(hào)的精確拷貝數(shù)的絕對(duì)定量，一般使用標(biāo)準(zhǔn)曲線。

A。 至少 5 個(gè)不同含量梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，包括未知樣品的含量

b. 每點(diǎn)重復(fù) 3 次

C。 添加 NTC 以檢查可能的污染

d. 將未知樣品的Ct值代入公式得到初始含量X025

2) 相對(duì)定量測(cè)定不同處理樣品中目的轉(zhuǎn)錄本之間的基因表達(dá)差異

不同的。

(1) 相對(duì)值(ΔCT)——未對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化——以質(zhì)量單位為標(biāo)準(zhǔn)

– 起始材料的準(zhǔn)確定量

(2) 均質(zhì)化表達(dá)——考慮初始樣本的差異——以?xún)?nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)——a

或在所有測(cè)試樣本中一致表達(dá)的多個(gè)已知參考基因

競(jìng)爭(zhēng)性PCR

?競(jìng)爭(zhēng)性PCR是將目的基因與參考標(biāo)準(zhǔn)在同一反應(yīng)管中進(jìn)行共擴(kuò)增，使用參考

測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)用作對(duì)照以顯示特定目標(biāo) DNA 或 RNA 分子的相對(duì)濃度。

? 競(jìng)爭(zhēng)性PCR有效控制了不同反應(yīng)管之間擴(kuò)增效率的差異。

競(jìng)爭(zhēng)性 PCR - 理論基礎(chǔ)

PCR擴(kuò)增過(guò)程中，PCR產(chǎn)物量用公式Y(jié)=A(1+R)n表示，其中Y代表PCR產(chǎn)物量，A代表初始模板量，R代表PCR擴(kuò)增效率，n代表PCR，當(dāng)PCR擴(kuò)增效率相同時(shí)，PCR產(chǎn)物量與起始模板量成反比。 —相似的基因序列，相同的質(zhì)粒，相同的質(zhì)粒結(jié)合位點(diǎn)，相同的擴(kuò)增效率。 在最終的混合PCR產(chǎn)物中，待分析樣品與競(jìng)爭(zhēng)底物終產(chǎn)物的比值直觀地反映了兩者初始狀態(tài)下核苷酸濃度的比值。

多重 + 競(jìng)爭(zhēng)性 PCR - 優(yōu)勢(shì)

A。 高通量：每個(gè)反應(yīng)孔可同時(shí)監(jiān)測(cè)10個(gè)基因；

b. 經(jīng)濟(jì)性：適用于大樣本多基因同時(shí)測(cè)定，大大縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高

實(shí)驗(yàn)效率。

C。 檢驗(yàn)區(qū)分度高：可有效區(qū)分低至15%的表達(dá)量差異；

d. 良好的重復(fù)性：已知 RNA 含量遞增稀釋后的多重表達(dá)分析

線性關(guān)系好 R2>0.99；

e. 準(zhǔn)確度高：目標(biāo)/參考基因片段與內(nèi)參基因片段序列基本一致

為保證最終擴(kuò)增產(chǎn)物與初始模板量比的真實(shí)反應(yīng)，一個(gè)或多個(gè)參數(shù)

光基因與被測(cè)基因在同一管內(nèi)反應(yīng)，各基因表達(dá)量良好。

使用競(jìng)爭(zhēng)性 PCR 進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

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