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本期我們將講述如何進行甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP-seq/m6A-seq）實驗，詳細介紹其技術原理、文庫構建和測序流程、信息分析流程和研究常規(guī)。

01

甲基化 RNA 免疫共沉淀 (MeRIP-seq/m6A-seq)

測序技術原理

表觀轉錄組是指對RNA進行化學修飾，在不改變RNA序列的情況下調節(jié)基因表達的現(xiàn)象。 細胞內RNA存在100多種修飾，其中大多數(shù)表觀遺傳修飾發(fā)生在tRNA和其他非編碼RNA上[1]。 mRNA的修飾無論是類型還是數(shù)量都相對較小。 下圖顯示了真核 mRNA 上發(fā)生的一些化學修飾[2]：

圖1：mRNA甲基化修飾示意圖

mRNA 上最豐富的修飾是腺苷酸 N6 位點的甲基化修飾（N6-、m6A）。 m6A 參與 mRNA 生命周期的各個方面 [2]。 m6A 修飾主要發(fā)生在 RRACH 等基序上（R = G 或 A，H = A、C 或 U）。 這類基序主要富集在終止密碼子和3'UTR處，即m6A主要出現(xiàn)在終止密碼子處。 sub 和 3'UTR 附近。 m6A 修飾由 m6A 甲基轉移酶 () 催化，由 m6A 去甲基酶 () 去除，并由 m6A 結合蛋白 () 識別并發(fā)揮作用 [3]。 m6A修飾廣泛存在于多種生物體中，包括病毒、酵母等高等動物、植物和人類[1,3]。

研究表明，m6A已知的主要功能是調節(jié)mRNA的穩(wěn)定性：細胞質中m6A修飾的mRNA可以被識別并富集到體內（P-body），加速mRNA的降解。 此外，m6A修飾還可以改變RNA的二級結構，調節(jié)靶標識別，從而調節(jié)mRNA的穩(wěn)定性。 在細胞核中，m6A修飾可以調節(jié)RNA剪接和核輸出過程，從而調節(jié)基因表達。 m6A 也可能與 DNA 甲基化相互作用。 下圖展示了目前已知的一些m6A與生物功能之間的關系：

圖2：m?A和生物學功能

早期的實驗方法已鑒定出rRNA和mRNA中m6A的存在，但由于實驗技術的限制，m6A的研究一直沒有重大進展。 近年來，RNA去甲基酶FTO的報道，使m6A修飾的研究再次進入人們的視野。 隨后MeRIP-seq/m6A-seq實驗方法的建立，為深入研究該修飾的分布和功能提供了機會[1]。

MeRIP-seq/m6A-seq 技術用于識別基因組中具有 m6A 修飾的區(qū)域。 其原理是通過特異性識別m6A修飾的抗體，在細胞內對帶有m6A修飾的RNA片段進行免疫共沉淀。 通過對沉淀的RNA片段進行高通量測序并將其與生物信息學分析相結合，可以系統(tǒng)地研究整個基因組中m6A修飾的狀態(tài)。 MeRIP-seq/m6A-seq是目前研究m6A修飾最廣泛使用的技術之一。

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甲基化 RNA 免疫共沉淀 (MeRIP-seq/m6A-seq)

實驗過程

從樣本處理到最終數(shù)據(jù)采集的每一步都會對數(shù)據(jù)質量和數(shù)量產生影響，而數(shù)據(jù)質量將直接影響后續(xù)信息分析的結果。 為了從源頭上保證測序數(shù)據(jù)的準確性和可靠性，樣本處理、建庫、測序的每一個步驟都必須嚴格控制，從根本上保證高質量數(shù)據(jù)的輸出。 流程圖如下：

(1)總RNA樣本檢測

RNA樣本的檢測主要包括三種方法：

(1)瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度及是否有污染，檢測到明顯的18S或28S主帶，條帶清晰；

（2）Qubit 2.0精確定量RNA濃度，檢測到的總RNA總量不低于10ug；

（3）2100準確檢測RNA的完整性，RIN值不低于7.5。

（二）圖書館建設

1.RNA片段化：

取10ug總RNA，加入RNA（），70℃反應10分鐘，將RNA斷裂成片段大小約為100nt的片段。 使用乙醇法沉淀片段化的RNA。

2. m6A富集：

用 IP（150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH 7.5）洗滌含有 A 和 G 的磁珠，然后與 5 ug m6A 抗體 () 4°C 孵育 2h； 用IP洗滌兩次，然后用IP去除磁珠。 重懸，加入片段化RNA，4℃翻轉4小時； 4°C IP 洗滌磁珠 3 次，然后使用 m6A 競爭性洗脫液，4°C 孵育 1 小時。 將含有洗脫的m6A RNA的上清液收集到新試管中并用苯酚:氯仿:異戊醇(125:24:1)純化。

3、圖書館建設：

使用? Total RNA-seq Kit v2 - Pico Input User按照說明進行IP和Input樣本的反轉錄和文庫構建； 使用XP珠進行片段大小選擇以獲得最終的文庫。

施工示意圖如下：

圖3：富集流程示意圖

(3)文庫質量檢查

建庫完成后，使用.0進行初步定量，將文庫稀釋至1ng/ul，然后使用2100檢測文庫大小。 大小達到預期后，使用qPCR方法準確定量文庫有效濃度（文庫有效濃度>2nM），確保文庫質量。

(4) 機上排序

文庫測試合格后，將根據(jù)有效濃度和目標機外數(shù)據(jù)量要求，在Nova平臺上對不同的文庫進行排序。 測序策略為PE150。

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甲基化 RNA 免疫共沉淀 (MeRIP-seq/m6A-seq)

信息分析過程

(1)原始離線數(shù)據(jù)的質量控制

原始離線數(shù)據(jù)為FASTQ格式，這是高通量測序的標準格式。 FASTQ 文件中的每四行是一個單元dnastar拼接序列，包含有關測序序列（讀?。┑男畔ⅰ?單元第一行是讀取的ID，通常以@符號開頭； 第二行是測序序列，即reads的序列； 第三行通常是+號，或者與第一行相同的信息； 第四行是堿基質量值，描述了序列第二行中堿基的準確性。 一個堿基對應一個堿基質量值，因此這一行和第二行的長度相同。 以下是已讀消息的示例：

圖 4：FASTQ 格式示例

原始離線數(shù)據(jù)包含文庫構建過程中引入的接頭序列和低質量堿基。 這些因素會導致隨后與基因組進行比較的讀數(shù)較少，從而導致信息較少，因此需要進行過濾。 使用軟件對原始數(shù)據(jù)執(zhí)行質量控制步驟，例如去除適配器序列和低質量堿基。 使用的參數(shù)為： :MeRIP-PE.fa:2:30:10:1:true :30:15 :15 :15 :15 : 30

(2)數(shù)據(jù)對比

過濾后的數(shù)據(jù)需要與參考基因組進行比較。 基因組上發(fā)生m6A修飾的片段會有大量的reads比較形成“峰”。 根據(jù)峰的位置，可以確定 m6A 修飾發(fā)生在基因組中的哪個位置。 根據(jù)。

使用[4]進行對齊。 該軟件可以快速將短序列與參考基因組比對，并且可以考慮和處理剪接位點，特別適合RNA數(shù)據(jù)的比對。 使用的參數(shù)是默認參數(shù)。 比對完成后，對結果路徑進行過濾，去除多次比對和低質量比對，以獲得更準確的比對結果。

(3) m6A修飾區(qū)域的檢測

MeRIP-seq 富集 RNA 上的 m6A 修飾區(qū)域，然后進行測序。 因此，在m6A修飾的區(qū)域中，IP文庫覆蓋的reads數(shù)量會明顯高于輸入文庫，從而形成“峰值”。 檢測這些峰的位置可以確定 RNA 上發(fā)生 m6A 修飾的位置。

在識別出m6A修飾后，可以對m6A修飾進行分析，例如注釋、分布統(tǒng)計和基序識別。

(4)差異m6A修飾區(qū)域的鑒定

使用 R 包進行差異 m6A 修飾（即差異峰）的識別 [5,6]。 這個R包首先合并需要比較的樣本的peak，然后計算每個樣本合并的peak中的累計reads數(shù)； 然后對這些reads進行標準化，使兩組樣本處于可比較的水平； 最后對兩組進行測試。 峰內樣本之間的reads數(shù)量是否存在顯著差異。 使用的參數(shù)為： =200 =30 HANGE = 1.5 =1.5 =200。

在識別差異性 m6A 修飾后，可以對差異性 m6A 修飾進行分析，例如注釋、分布統(tǒng)計和基序識別。

(5) mRNA基因表達水平分析

m6A-seq的輸入文庫相當于RNA-seq文庫dnastar拼接序列，可用于分析基因表達，識別差異表達基因。 通過對映射到基因組區(qū)域或基因外顯子區(qū)域的測序序列（讀數(shù)）進行計數(shù)來估計基因表達水平。 讀取計數(shù)除了與基因的真實表達水平成正比外，還與基因的長度和測序深度正相關。 為了使不同基因、不同實驗之間計算的基因表達水平具有可比性，使用TPM對reads數(shù)量進行標準化。 該算法考慮了測序深度和基因長度對計數(shù)的影響。 它是目前計算基因表達水平最常用的方法。 一。

圖5：TPM計算公式 注：Ri代表基因的數(shù)； Li代表基因的長度（kbp），選擇最長的轉錄本作為基因的長度。 表達量計算軟件為[7]，使用默認參數(shù)，使用TPM顯示基因表達量。

(6) 篩選、鑒定及表達量計算

通過組裝轉錄本，可以發(fā)現(xiàn)注釋文件之外的新轉錄本。 這些新轉錄本在一系列嚴格條件下進行篩選，并鑒定出非編碼 RNA。

（1）使用軟件[7]組裝轉錄本，獲取每個樣本中的所有轉錄本，并將注釋文件中未出現(xiàn)的轉錄本標記為新轉錄本。 新轉錄本的過濾條件為： a) 對于每個樣本的組裝注釋文件，過濾掉外顯子號 >= 2 但 FPKM=1 但 FPKM 的轉錄本

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