新型冠狀病毒爆發(fā)后，早期診斷成為控制疫情的關(guān)鍵，熒光PCR技術(shù)成為首選的初篩檢測(cè)方法。 目前核酸檢測(cè)率僅為30-40%，檢測(cè)試劑盒的靈敏度令人擔(dān)憂。 本期推薦林敬忠博士從引物和探針設(shè)計(jì)的角度對(duì)試劑盒的敏感性進(jìn)行分析，以饗讀者。

1 簡(jiǎn)介

新型冠狀病毒爆發(fā)后，早期診斷成為控制疫情的關(guān)鍵，熒光PCR技術(shù)成為首選的初篩檢測(cè)方法。 截至目前，已有多家企業(yè)獲得新型冠狀病毒熒光PCR檢測(cè)試劑的臨床注冊(cè)批件，已有近百家企業(yè)研發(fā)出類似產(chǎn)品。 近期，有不少聲音反映現(xiàn)有的新冠病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒靈敏度較低。 目前檢出率僅為30-40%，且多次漏檢。 業(yè)界對(duì)此進(jìn)行了廣泛的討論，一致認(rèn)為造成檢出率低、假陰性率高的原因有很多，包括試劑盒的靈敏度、試劑盒原材料的質(zhì)量、核酸檢測(cè)的效率等。酸提取、儀器設(shè)備的質(zhì)量以及操作失誤。 等，但尚未系統(tǒng)分析試劑盒靈敏度低的原因。 作者認(rèn)為引物和探針設(shè)計(jì)是決定試劑靈敏度的關(guān)鍵。 設(shè)計(jì)中的問(wèn)題屬于固有缺陷，很難通過(guò)優(yōu)化試劑盒成分和調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件來(lái)顯著改善。

早期診斷的敏感性關(guān)系到新型冠狀病毒疫情防控的成敗。 同時(shí)，未來(lái)還將有大量企業(yè)申請(qǐng)?jiān)摦a(chǎn)品的注冊(cè)審批，并最終投入試驗(yàn)市場(chǎng)，將對(duì)人們的健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。 疫情發(fā)生后，世界衛(wèi)生組織公布了多國(guó)設(shè)計(jì)的新冠病毒熒光PCR引物探針序列。 作者多年從事分子檢測(cè)試劑的研發(fā)，尤其是熒光PCR技術(shù)。 新型冠狀病毒疫情發(fā)生后，我們也進(jìn)行了相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)。 我們發(fā)現(xiàn)世界衛(wèi)生組織在不同國(guó)家發(fā)布的一些引物和探針設(shè)計(jì)存在明顯缺陷。 本文以美國(guó)CDC設(shè)計(jì)的N基因引物探針為例，探討熒光PCR引物和探針設(shè)計(jì)的基本原理，并提出一些建議供同行參考，避免走彎路和資源浪費(fèi)，可以認(rèn)為為抗擊疫情盡自己最大的努力。 力量份額。

任何技術(shù)都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。 從不同的角度，側(cè)重點(diǎn)不同，或者使用不同的參數(shù)、算法或軟件，結(jié)論也可能不同。 畢竟理論分析與臨床樣本檢測(cè)的結(jié)果不一樣。 產(chǎn)品的敏感性最終必須經(jīng)過(guò)臨床試驗(yàn)并滿足注冊(cè)檢測(cè)要求。 本文觀點(diǎn)難免有偏頗，歡迎批評(píng)指正。

2. 探針熒光PCR的基本原理

實(shí)時(shí)熒光PCR是一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)特定核酸靶序列PCR擴(kuò)增的技術(shù)。 探針?lè)ㄊ菍?shí)時(shí)熒光PCR中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。 其基本原理是在反應(yīng)中添加一對(duì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針。 探針的 5' 端用報(bào)告熒光團(tuán)標(biāo)記，3' 端用猝滅熒光團(tuán)標(biāo)記。 當(dāng)探針完好時(shí)，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的作用，報(bào)告基團(tuán)的熒光被猝滅基團(tuán)吸收，發(fā)出與儀器采集波長(zhǎng)不同的熒光。 無(wú)法檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)，因此探針必須依靠 Taq 酶的 5'-3' 外核活性dnastar引物設(shè)計(jì)，引物與模板結(jié)合后，將已經(jīng)與模板結(jié)合的探針切割成雙鏈隨著雙鏈合成的進(jìn)行，報(bào)告熒光基團(tuán)從猝滅基團(tuán)中逸出。 屏蔽以發(fā)射儀器應(yīng)檢測(cè)到的熒光信號(hào)。 常用的報(bào)告基團(tuán)包括HEX、FAM、ROX、JOE、VIC等，猝滅基團(tuán)包括TAMRA、BHQ等。

3. 利用探針?lè)ㄔO(shè)計(jì)熒光PCR引物和探針

一些最基本的原則可以參考美國(guó)ABI（ ）3.0指南（表1）。

表 1：熒光 PCR 探針和引物設(shè)計(jì)指南（3.0，ABI）

根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，最重要的參數(shù)包括引物探針位置、Tm值、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體。 下面以WHO公布的美國(guó)CDC的N基因引物探針（表2）為例詳細(xì)討論。

表2：美國(guó)CDC設(shè)計(jì)的引物探針序列

01

引物探針位置

引物和探針的設(shè)計(jì)原則中，最重要的是在保證特異性（避免假陽(yáng)性）的同時(shí)，避免假陰性（漏檢）。 因此，組內(nèi)的序列（需要檢測(cè)的）應(yīng)該選擇保守的（即盡量避免突變）。 或者使用簡(jiǎn)并序列）、組間的特定區(qū)域（控制序列）。 另外，為了獲得最佳的放大效果，還應(yīng)盡可能滿足表1的基本要求。

以SARS和蝙蝠冠狀病毒的N基因序列為對(duì)照，對(duì)新型冠狀病毒的N基因序列進(jìn)行測(cè)序。 從圖1、圖2、圖3可以看出，美國(guó)CDC的設(shè)計(jì)中，除了第二組上游引物不具有特異性外，其余探針和引物的位置選擇都是為了保留組內(nèi)的特定區(qū)域。 第二組探針和下游引物位于特定區(qū)域，因此不會(huì)發(fā)生非特異性擴(kuò)增。

圖1：美國(guó)CDC 2019-nCoV第一組引物和探針的位置

圖2：美國(guó)CDC 2019-nCoV第二組引物和探針的位置

圖3：美國(guó)CDC 2019-nCoV第三組引物和探針的位置

第三組設(shè)計(jì)的探針N3P對(duì)2019-nCoV沒(méi)有特異性（可以同時(shí)與蝙蝠冠狀病毒結(jié)合）。 5'端的第二個(gè)位置設(shè)置為Y，這意味著T/C簡(jiǎn)并性。 它無(wú)法區(qū)分新型冠狀病毒和蝙蝠冠狀病毒。 和SARS病毒。 然而，上游和下游引物均對(duì) 2019-nCoV 具有特異性，可能不會(huì)產(chǎn)生非特異性（假陽(yáng)性）擴(kuò)增。

02

Tm值

探針?lè)晒釶CR通常采用兩步法，即94℃左右變性，60℃退火延伸。 因此，引物的Tm值通常設(shè)計(jì)為60±2℃，探針的Tm值為70±2℃。

圖4：美國(guó)第一個(gè)設(shè)計(jì)的Tm值

圖5：USCDC第二組N基因Tm值

圖6a：USCDC N基因第三組Tm值，探針5'端第二條序列為C

圖6b：USCDC N基因的第三組Tm值，探針5'端第二個(gè)序列為T(mén)

從圖4、圖5、圖6可以看出，這三組設(shè)計(jì)中的Tm值基本滿足表1的要求。第三組探針N3P 5'端的第二個(gè)序列設(shè)計(jì)為為 Y（T/C 簡(jiǎn)并）。 當(dāng)為C時(shí)（圖6a），探針N3P的Tm值稍高，但通過(guò)優(yōu)化應(yīng)該不會(huì)成為主要問(wèn)題。

03

引物和探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)

穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)（二聚體或發(fā)夾）是降低引物和探針利用效率的重要因素，尤其是探針的發(fā)夾，很容易導(dǎo)致探針利用率降低，導(dǎo)致熒光信號(hào)低，影響檢測(cè)靈敏度。 通常發(fā)夾的dG應(yīng)控制≥-1.0（注：dG是用來(lái)衡量裂解二聚體或發(fā)夾所需能量的參數(shù)，二級(jí)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，裂解所需的能量越大，dG越小）。

利用DNA Star軟件分析了美國(guó)CDC設(shè)計(jì)的三組引物探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 結(jié)果（圖7）發(fā)現(xiàn)第一組下游引物N1R具有穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（dG=-2.3kc/m），第三組探針N3P具有稍穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（dG=-1.3kc/m）。 m)，其余引物和探針不具有穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

圖 7：USCDC 引物和探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)

04

二聚體

設(shè)計(jì)時(shí)dnastar引物設(shè)計(jì)，通?？刂贫垠w（自二聚體或配對(duì)二聚體）在dG>-5.0kc/m，優(yōu)選dG>-3.6kc/m。 從圖8所示的三組引物探針的自二聚體可以看出，第二組探針具有非常穩(wěn)定的自二聚體（dG=-13.1kc/m），并且第二組上游引物N2F具有穩(wěn)定的自二聚體(dG=-9.3kc/m)，第三組下游引物具有相對(duì)穩(wěn)定的自二聚體(dG=-7.0kc/m)。

圖9顯示美國(guó)CDC的第二組引物探針具有相對(duì)穩(wěn)定的配對(duì)二聚體（dG=-9.0kc/m）。 圖10顯示第三組有兩個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的配對(duì)二聚體(dG=-10.1kc/m)。

圖8：美國(guó)CDC基因引物和探針的自二聚體

圖9：美國(guó)CDC第二組引物探針的配對(duì)二聚體

圖 10：USCDC 第三組引物-探針配對(duì)二聚體

另外，當(dāng)使用一管進(jìn)行多重檢測(cè)（多重PCR）時(shí)，即一管同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)或多種病原體時(shí)，還必須考慮不同位點(diǎn)之間的引物探針配對(duì)二聚體。 例如，當(dāng)?shù)谝唤M和第二組組合時(shí)（圖11），第一組的正向引物和第二組的探針具有相對(duì)穩(wěn)定的配對(duì)二聚體（dG=-8.3kc/m）。 當(dāng)?shù)谝唤M和第三組組合時(shí)（圖12），第一組的探針和第三組的正向引物具有穩(wěn)定的二聚體（dG=-12.2kc/m）。 當(dāng)?shù)诙M和第三組組合時(shí)，第二組的上游引物和第三組的上下游引物各自具有相對(duì)穩(wěn)定的二聚體（dG=-7.0kc/m 圖13）。

圖11：美國(guó)CDC N基因第一組和第二組配對(duì)二聚體

圖12：美國(guó)CDC N基因第一組和第三組配對(duì)二聚體

圖13：美國(guó)CDC N基因第二組和第三組配對(duì)二聚體

綜上所述，美國(guó)CDC設(shè)計(jì)的三套引物探針的位置選擇和Tm值設(shè)計(jì)都比較合理，但二級(jí)結(jié)構(gòu)也比較穩(wěn)定。 第一組反向引物N1R具有非常穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（dG=-2.3kc/m，圖7）。 第二組探針的自二聚體非常穩(wěn)定（dG=-13.1kc/m，圖8），上游引物的自二聚體也比較穩(wěn)定（dG=-9.3kc/m，圖8） ），比較穩(wěn)定。 配對(duì)二聚體較多（dG=-6.8~9.0kc/m，圖9），引物和探針的利用效率會(huì)比較低。 第三組探針N3P具有相對(duì)穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（dG=-1.3kc/m，圖7），探針和引物值均具有相對(duì)穩(wěn)定的配對(duì)二聚體（圖10）。

4、結(jié)果判定

美國(guó)CDC對(duì)結(jié)果提出了意見(jiàn)，認(rèn)為只有三個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線同時(shí)超過(guò)閾值才能判斷為陽(yáng)性（圖11）。

筆者認(rèn)為，這一判斷沒(méi)有理論依據(jù)。 基于探針的熒光PCR除了一對(duì)特異性引物外，還具有特異性探針。 基于設(shè)計(jì)的非特異性擴(kuò)增的理論概率非常小。 在新型冠狀病毒的檢測(cè)中，以美國(guó)CDC的第一組引物探針為例。 從圖1可以看出，SARS病毒在上游引物處有3個(gè)bp的插入，無(wú)法擴(kuò)增。 蝙蝠病毒位于上游引物。 有4個(gè)突變，探針有1個(gè)突變，下游引物有5個(gè)突變。 理論上，由于不匹配而檢測(cè)到最接近的蝙蝠序列（誤報(bào)）的概率為（1/4）10=9.-7。 如果出現(xiàn)假陽(yáng)性，最可能的原因是交叉污染或氣溶膠污染。 正確的判斷應(yīng)該是，如果上述三個(gè)位點(diǎn)至少有一個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線超過(guò)閾值，則可以判斷該病例為陽(yáng)性。 目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的熒光PCR檢測(cè)試劑大多只使用一個(gè)位點(diǎn)。

五、結(jié)論與建議

引物和探針的設(shè)計(jì)原則中，最重要的是在保證特異性（避免假陽(yáng)性）的同時(shí)，避免假陰性（漏檢）。 因此，組內(nèi)的序列（需要檢測(cè)的）應(yīng)該選擇保守的（即盡量避免突變）。 或者使用簡(jiǎn)并序列）和組間特定區(qū)域（控制序列），同時(shí)最大限度地提高反應(yīng)中引物和探針的利用效率。 作者認(rèn)為參數(shù)的重要性是引物探針的位置、探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、探針與上游引物的相對(duì)位置、Tm值、引物發(fā)夾、二聚體。

筆者對(duì)WHO公布的7個(gè)國(guó)家設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行了詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)它們都存在一定的缺陷，其中有的缺陷比較明顯，主要體現(xiàn)在：

1）不具體（德國(guó)E基因、香港大學(xué)Orf1b基因）；

2）探針發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（中國(guó)疾控中心基因探針、德國(guó)SARS RdRP基因探針P1、香港大學(xué)N基因探針）；

3）引物和探針相對(duì)位置不合理（中國(guó)疾控中心的N基因、德國(guó)的E基因、香港大學(xué)的Orf1b基因和E基因（設(shè)計(jì)在反向鏈上）、日本的N基因）；

4）Tm值不合理（中國(guó)疾控中心的N基因和基因、德國(guó)SARS的RdRP基因和E基因、香港大學(xué)的Orf1b基因和N基因、日本的N基因、泰國(guó)的N基因）；

5）引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（美國(guó)CDC N基因第一組反向引物、香港大學(xué)Orf1b基因正向和反向引物、美國(guó)CDC N基因正向引物香港大學(xué)）；

6）引物探針的自二聚體穩(wěn)定性（中國(guó)CDC基因反向引物、美國(guó)CDC第二套N基因探針N2P、德國(guó)E基因探針P1、香港大學(xué)N基因正向引物及探針）；

7）引物探針配對(duì)二聚體穩(wěn)定（中國(guó)疾控中心的N基因、美國(guó)N基因第二組、第三組、德國(guó)E基因）。

作者認(rèn)為不能使用具有穩(wěn)定發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針。 距離上游引物太遠(yuǎn)的探針擴(kuò)增效率較低，難以通過(guò)優(yōu)化提高效率，應(yīng)盡量避免。 其他二級(jí)結(jié)構(gòu)可通過(guò)添加 PCR 加速劑或添加過(guò)量組分（引物探針、Taq 酶等）來(lái)改進(jìn)。 不理想的Tm值可以通過(guò)調(diào)整退火和延伸溫度來(lái)改善，但上面設(shè)計(jì)的一些引物和探針的Tm值幾乎相同，這是不合理的，應(yīng)該避免。

事實(shí)上，新冠病毒的基因組與最接近的蝙蝠冠狀病毒有4%的差異，與SARS病毒有20%的差異。 目前的數(shù)據(jù)顯示，武漢新型冠狀病毒內(nèi)部的差異非常小，大約在10萬(wàn)點(diǎn)左右。 第三(3.3x10-5)，基因組或N基因和基因中有很多區(qū)域可以設(shè)計(jì)特異性、高效的引物探針，用于熒光PCR檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

科學(xué)技術(shù)面前沒(méi)有真正的捷徑。 科學(xué)設(shè)計(jì)引物和探針是開(kāi)發(fā)熒光PCR檢測(cè)試劑的基礎(chǔ)，是保證試劑盒靈敏度和特異性的最基本要素。 為避免走彎路和資源浪費(fèi)，建議業(yè)內(nèi)廠商嚴(yán)格遵循熒光PCR技術(shù)引物和探針設(shè)計(jì)原則來(lái)開(kāi)發(fā)新型冠狀病毒熒光PCR檢測(cè)試劑。

作者簡(jiǎn)介：林敬忠，博士加拿大多倫多大學(xué)博士，美國(guó)加州大學(xué)博士后。 深圳市海外高層次B類人才。 現(xiàn)任深圳市薩格諾生物科技有限公司首席科學(xué)家/總經(jīng)理。曾任深圳市泰泰基因工程有限公司創(chuàng)始人/總經(jīng)理、美國(guó)Lynx 高級(jí)研究員。

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